工作流程

開發(fā)色譜分析方法通常需要耗費很多時間，而且難度很大。傳統(tǒng)方法通常是選擇一個優(yōu)選或經(jīng)常使用的溶劑、pH值、緩沖液和色譜柱組合作為開始點，然后對流動相組成進(jìn)行 調(diào)節(jié)，直到摸索出滿意的方法。但此過程非常費力，而且經(jīng)常得不到滿意的方法。更系統(tǒng)性的方法是利用良好的實驗設(shè)計和根據(jù)本大綱中描述的工作流程，高效快速開發(fā)高質(zhì)量的反相色譜分析法。本方法開發(fā)工作流程包括測試方法摸索，其對如pH值、有機(jī)改性劑和色譜柱化學(xué)性質(zhì)等選擇性因素進(jìn)行評估，測定那些能夠通過控制選擇性從而實現(xiàn)所需分辨率的最有效的試驗參數(shù)，然后對摸索試驗得到的最優(yōu)分離方案進(jìn)行優(yōu)化或微調(diào)以得到最終分析方法，然后對分析方法進(jìn)行驗證以確保滿足預(yù)期方法目標(biāo)。



開始點

為了設(shè)計一個有效的測試方法摸索試驗，盡可能多地搜集關(guān)于樣品和被分析物化學(xué)特性的信息是很重要的。

方法開發(fā)所需信息
· 樣品溶解性能
· 化學(xué)結(jié)構(gòu)
· 被分析物數(shù)量
需要分離多少分析對象色譜峰？
· 功能基團(tuán)：被分析物有何區(qū)別？
有無可電離基團(tuán)？電離常數(shù)？
pH值如何影響色譜分析？

·檢測
需要或可能采用何種檢測？
被分析物是否有紫外吸收？
max?

· 濃度范圍和定量要求？
需要多高檢測水平？
需要多大定量限？
· 樣品基質(zhì)影響
是否有阻礙分離或檢測的基質(zhì)影響？

方法使用目的

在開發(fā)一種測試方法之前，還需要考慮，是否理解和明確了測試方法的目標(biāo)和使用目的，清楚理解使用目的將有助于確定必須要滿足的性能參數(shù)以及驗證方法所需關(guān)鍵參數(shù)，例如可能需要從樣品的所有組分中分離一種對象被測物的方法，或者可能需要既能從其它組分中分離對象被測物、也能使所有組分之間能夠相互分離的方法，其它考慮因素可能還包括：需要多大通量？需要多大分辨率？可以接受的拖尾因子等。我們采用開發(fā)從相關(guān)化合物中分離帕羅西汀的方法來展示系統(tǒng)方法。

測試方法摸索

當(dāng)選擇合適的色譜柱時，不同基體顆粒(雜化、硅膠、聚合物)的特性差別，會造成保留性能、選擇性的差別，了解這一點是很重要的。根據(jù)基質(zhì)表面殘余的硅醇基團(tuán)數(shù)量的不同以及封端原因，可能會導(dǎo)致次級效應(yīng)，另外不同的鍵合相可導(dǎo)致顯著的選擇性差別以及其它特性。

不同配體、不同選擇性

·疏水性
- 更長的烷烴鏈提供更長的保留時間。
·硅醇活性
- 影響譜峰對稱性和次級效應(yīng)。
·水解穩(wěn)定性
- 顆粒鍵合位點上配體數(shù)量越多，色譜柱壽命越長。
·配體密度
- 影響樣品負(fù)載能力。

用傳統(tǒng)的HPLC設(shè)備對具有不同pH值和有機(jī)改性劑的大量色譜柱進(jìn)行摸索試驗需要大量時間，而使用安裝了ACQUITY UPLC 色譜柱管理器和填充了亞-2微米顆粒的高分辨率短色譜柱的ACQUITY UPLC®設(shè)備，可使試驗從幾天縮短到幾小時。



色譜柱摸索試驗：使用安裝了ACQUITY UPLC 色譜柱管理器和ACQUITY UPLC色譜柱的ACQUITYUPLC設(shè)備測試摸索條件如圖所示，圖示這些條件的最終目標(biāo)是得到一系列不同的色譜圖，其能提供選擇合適色譜柱所需信息。BEH C18色譜柱是非常好的通用C18，適于寬pH值范圍使用，BEH Shield RP18為烷烴鏈C18提供選擇性補充，BEH Phenyl色譜柱為這兩種C18色譜柱提供選擇性補充，為了滿足極性保留的試驗設(shè)計需求，也可選用HSS T3色譜柱。

pH 值的影響
·影響帶如下可電離基團(tuán)等的被測物。
- 胺
- 羧酸
- 酚
·有的化合物帶一個或更多可電離基團(tuán)
·pH值變化可產(chǎn)生最強的選擇性效果


反相保留性能：分析pH值如何影響反相色譜分析中的保留時間和穩(wěn)定性是很重要的，為了得到可電離化合物的最佳保留性能，被測物不應(yīng)帶電或被離子化，因此酸性被測物應(yīng)該使用低pH值，堿性被測物應(yīng)該使用高pH值，中性材料不帶可電離基團(tuán)，因此不受pH值影響。這些曲線也可被看作滴定曲線，其拐點是分子的表觀pKa值，因為pH值的微小變化就能導(dǎo)致保留時間和選擇性的急劇變化，所以測試方法采用的pH值不能位于分子pKa附近，穩(wěn)定區(qū)域是曲線的水平位置部分。


pH值選擇和色譜柱選擇：此色譜圖中，由于帕羅西汀及其相關(guān)化合物的帶電狀態(tài)發(fā)生變化，pH 10比pH 3在BEH C18色譜柱上的保留時間更長，在這一點上，由于具有更高分辨率和更好的選擇性，pH 10是適合被測物的pH值。下一步是評估在相同pH 10值下三種不同色譜柱的色譜圖，以選擇具有最佳分辨率的色譜柱。與其它純硅膠色譜柱相同，HSS T3色譜柱只能用于pH值2-8環(huán)境下，因此不在評估之列，三種色譜柱都顯示了可檢測所有組分的能力，由于C18的通用性，因此選擇BEH C18色譜柱來對比不同有機(jī)改性劑的選擇性。

選擇有機(jī)改性劑

用于反相分離的典型溶劑是甲醇和乙腈，除了通用性外，還具有良好的化學(xué)特性，兩者的洗脫能力和粘度不同，甲醇中存在氫鍵，具有不同的獨特選擇性。
·甲醇
- 弱洗脫劑
- 帶氫鍵溶劑
·乙腈
- 非質(zhì)子溶劑
- 強洗脫劑
- 低粘度

選擇溶劑：如上色譜圖顯示，甲醇是比乙腈更弱的洗脫劑，因此表現(xiàn)更長的保留時間，而乙腈對此類被測物中的所有組分具有更好的分離性能，因此采用BEH C18色譜柱和乙腈溶劑在pH值為10的條件下繼續(xù)優(yōu)化分離。

測試方法優(yōu)化

可通過對參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)以微調(diào)和優(yōu)化分離過程，物理參數(shù)-梯度坡度可用于調(diào)節(jié)保留性和選擇性，但需要記住的是梯度坡度經(jīng)常是分辨率和選擇性的綜合平衡結(jié)果。另一個可優(yōu)化參數(shù)是溫度，任何化學(xué)過程都受溫度影響，溫度不同可導(dǎo)致選擇性的巨大差別。



色譜分析方法開發(fā)：當(dāng)相關(guān)化合物濃度降低時，帕羅西汀相關(guān)化合物B和D的分辨率會急劇降低，這是由于其和帕羅西汀峰的濃度水平不相稱造成的，需要繼續(xù)優(yōu)化。

方法優(yōu)化和梯度坡度

·更小的梯度坡度可提高分辨率
- 降低梯度坡度將降低靈敏度。
·更陡的梯度坡度將壓縮譜峰，經(jīng)常會降低分辨率。
- 增加梯度坡度將增加靈敏度。
·改變梯度坡度需要平衡譜峰高度和靈敏度。
·保留性能和選擇性的變化。

方法優(yōu)化和溫度

·降低移動相粘度。
·降低背壓。
- 如果流動速度維持恒定。
·改善被測物分散性。
- 優(yōu)化線性速度更高。
·保留性能和選擇性的變化。

溫度會影響中間的每一個化學(xué)過程，例如增加溫度會降低移動相的粘度，如果流動速度恒定將導(dǎo)致系統(tǒng)背壓降低，高溫將改變固定相和流動相之間的分配速率，然而由于提高了被測物分散性，會加快優(yōu)化線性速度。對溫度變化敏感的化合物，溫度的微小變化都會導(dǎo)致選擇性發(fā)生獨特變化。



色譜分析方法優(yōu)化：此例子中，溫度以15°C的步幅從30°C開始上升到40°C和60°C，隨著色譜柱溫度增加，組分的分離性能改善，另外被測物的分散性提高，譜峰更尖銳，色譜柱溫度為60°C時分離效果最佳。

方法驗證和注意點

方法驗證用于確認(rèn)分析方法的特性能否滿足應(yīng)用要求，驗證過程中需要評估的典型色譜法特性是專屬性、線性、范圍、檢測限、定量限、準(zhǔn)確度、精度、耐用性。

分析方法驗證經(jīng)常是由多個步驟組成的反復(fù)人工過程，需要進(jìn)行大量的色譜測試，以充分評估所有八種特性，審視、計算和管理這些過程獲得的所有數(shù)據(jù)可能具有一定的難度。EmpowerTM 2 Method Validation Manager采用自動化的驗證過程，使數(shù)據(jù)審視更加順暢，極大提高了驗證過程的效率和可靠性。通過使用包括摸索試驗和優(yōu)化的方法開發(fā)系統(tǒng)策略可明顯提高色譜測試方法的開發(fā)效率。設(shè)計試驗研究包括影響選擇性的多個參數(shù)，例如固定相、pH值、有機(jī)改性劑，自動化運行極大加速了測試方法開發(fā)流程。

合理審視數(shù)據(jù)后，完成最終測試方法經(jīng)常是微調(diào)和優(yōu)化如梯度坡度和溫度等變量的過程。為了保證所開發(fā)的方法能夠滿足應(yīng)用要求，需要使用事先確定的性能參數(shù)對方法進(jìn)行驗證。

驗證結(jié)果：使用Empower 2 Method Validation Manager對帕羅西汀方法的驗證結(jié)果如下：