ELISPOT酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析簡(jiǎn)介
ELISPOT 技術(shù)簡(jiǎn)介
隨著酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用 , 使體外檢測(cè)各種細(xì)胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應(yīng)答機(jī)制時(shí)以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ ELISA ）檢測(cè)體液中游離的細(xì)胞因子（ CK ）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或 CK 的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及 CK 的水平。 80 年代，國(guó)外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和 CK 分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ ELISPOT ）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對(duì)探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。
ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破傳統(tǒng) ELISA 法，是定量 ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于：
- ELISA 通過(guò)顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。
- ELISPOT 也是通過(guò)顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過(guò)德國(guó)AID的ELISPOT 分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)， 1 個(gè)斑點(diǎn)代表 1 個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。（某些研究不僅要測(cè)細(xì)胞因子生成量，還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率）
- 由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從 20 萬(wàn) -30 萬(wàn)細(xì)胞中檢出 1 個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。
- 捕獲抗體為 BD 、 R&D 、 Mabtech 、 Diaclone 生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。
ELISPOT 檢測(cè)原理
細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后， 被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，應(yīng)用德國(guó)AID的ELISPOT 酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)可以對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行分析得出結(jié)果。
ELISPOT 分析儀的出現(xiàn)解決了以下問(wèn)題
- 哪些斑點(diǎn)是抗原特異性 T 細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)具有進(jìn)一步分析價(jià)值），哪些是無(wú)關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)沒(méi)有 T 細(xì)胞研究?jī)r(jià)值）
- 斑點(diǎn)大小的意義
- 在對(duì)不同細(xì)胞因子計(jì)數(shù)和分析時(shí)，如何定義斑點(diǎn)最大和最小尺寸
- 如何從單個(gè)細(xì)胞基礎(chǔ)上分析
- 實(shí)驗(yàn)精確度有多高？如果一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生相似的細(xì)胞因子，在多大程度上會(huì)干擾分析結(jié)果？
幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)才能使結(jié)果更有意義？
簡(jiǎn)介ELISPOT技術(shù)
ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術(shù)原理與ELISA相似。其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是在96微孔培養(yǎng)盤(pán)底部披覆PVDF薄膜，用來(lái)吸附特殊挑選、且無(wú)毒性（不含sodium azide、內(nèi)毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)分離處理后，會(huì)被分配到微孔盤(pán)上，再接受適當(dāng)?shù)目乖碳�，并將微孔盤(pán)放置于溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)一段時(shí)間。一般而言，記憶型T細(xì)胞在受抗原刺激數(shù)小時(shí)后會(huì)開(kāi)始分泌細(xì)胞激素，此時(shí)局部(在緊靠分泌細(xì)胞的周?chē)?FONT face="Times New Roman">)分泌出的細(xì)胞激素會(huì)被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤(pán)中的細(xì)胞被移除并清洗后，被捕獲的細(xì)胞激素可進(jìn)一步使用生物素（Biotin）標(biāo)記的二次抗體來(lái)標(biāo)志，其后再以結(jié)合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應(yīng)作用的細(xì)胞會(huì)留下約10-20mm大小染色的斑點(diǎn)。
ELISPOT技術(shù)的過(guò)去
ELISPOT是20多年前便己研發(fā)成功的老技術(shù)。Czerkinsky 等人率先在1983年，運(yùn)用該技術(shù)成功地檢測(cè)出因受激而分泌抗體的B細(xì)胞頻率。從那時(shí)起世界各國(guó)免疫學(xué)者便開(kāi)始一長(zhǎng)期的ELISPOT Cytokine技術(shù)競(jìng)賽，每個(gè)團(tuán)隊(duì)都希望能率先將此一技術(shù)推廣來(lái)研究T細(xì)胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境，藉由偵測(cè)T細(xì)胞分泌的各類(lèi)細(xì)胞因子，來(lái)定量機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時(shí)預(yù)測(cè)體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進(jìn)行的下游免疫反應(yīng)。
ELISPOT Cytokine技術(shù)雖說(shuō)操作簡(jiǎn)單，但該技術(shù)并沒(méi)能如預(yù)期地很快地被成功應(yīng)用在ex vivo T細(xì)胞功能研究。要讓ELISPOT技術(shù)從B細(xì)胞免疫走向T細(xì)胞免疫的產(chǎn)生的第一個(gè)主要問(wèn)題，便是靈敏度的提升，因?yàn)?FONT face="Times New Roman">T細(xì)胞因子較之B細(xì)胞免疫球蛋白產(chǎn)量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對(duì)抗體的品質(zhì)、呈色底膜的材質(zhì)等幾個(gè)技術(shù)性的問(wèn)題，使當(dāng)時(shí)多數(shù)研究團(tuán)隊(duì)很難獲得清晰的斑點(diǎn)，結(jié)果是敏感度不夠、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低。這問(wèn)題直到1996美國(guó)俄亥俄卅Case Western Reserve大學(xué)Paul Lehmann團(tuán)隊(duì)引進(jìn)PVDF薄膜的應(yīng)用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術(shù)因斑點(diǎn)呈色問(wèn)題造成低敏感度的缺失。與原來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來(lái)吸附單株抗體，使T細(xì)胞分泌的各類(lèi)細(xì)胞因子能在細(xì)胞周?chē)徒环�，讓呈色斑點(diǎn)集中、清晰、對(duì)比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)薄膜（Panel B）并行實(shí)驗(yàn)的比較結(jié)果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過(guò)完全相同的實(shí)驗(yàn)，Panel A呈現(xiàn)較清晰的小色點(diǎn)。
ELISPOT Cytokine技術(shù)雖說(shuō)操作簡(jiǎn)單，但該技術(shù)并沒(méi)能如預(yù)期地很快地被成功應(yīng)用在ex vivo T細(xì)胞功能研究。要讓ELISPOT技術(shù)從B細(xì)胞免疫走向T細(xì)胞免疫的產(chǎn)生的第一個(gè)主要問(wèn)題，便是靈敏度的提升，因?yàn)?FONT face="Times New Roman">T細(xì)胞因子較之B細(xì)胞免疫球蛋白產(chǎn)量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對(duì)抗體的品質(zhì)、呈色底膜的材質(zhì)等幾個(gè)技術(shù)性的問(wèn)題，使當(dāng)時(shí)多數(shù)研究團(tuán)隊(duì)很難獲得清晰的斑點(diǎn)，結(jié)果是敏感度不夠、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低。這問(wèn)題直到1996美國(guó)俄亥俄卅Case Western Reserve大學(xué)Paul Lehmann團(tuán)隊(duì)引進(jìn)PVDF薄膜的應(yīng)用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術(shù)因斑點(diǎn)呈色問(wèn)題造成低敏感度的缺失。與原來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來(lái)吸附單株抗體，使T細(xì)胞分泌的各類(lèi)細(xì)胞因子能在細(xì)胞周?chē)徒环�，讓呈色斑點(diǎn)集中、清晰、對(duì)比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)薄膜（Panel B）并行實(shí)驗(yàn)的比較結(jié)果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過(guò)完全相同的實(shí)驗(yàn)，Panel A呈現(xiàn)較清晰的小色點(diǎn)。
第二個(gè)技術(shù)性問(wèn)題是ELISPOT Cytokine實(shí)驗(yàn)分析的幾個(gè)基本假設(shè)缺乏科學(xué)實(shí)證，也使得該技術(shù)在當(dāng)時(shí)并沒(méi)受到該有的廣泛重視。沒(méi)有科研人員嘗試去厘清一些基礎(chǔ)但很重要的問(wèn)題，諸如；
· 實(shí)驗(yàn)所得的斑點(diǎn)是抗原特定T細(xì)胞所生產(chǎn)，還是旁觀細(xì)胞受Cytokine刺激的次級(jí)效應(yīng)？
· 斑點(diǎn)的小或大有何生理意義；如何決定cutoff值？
· 能否相信斑點(diǎn)是由單一的細(xì)胞造成？ · ELISPOT Cytokine分析技術(shù)能準(zhǔn)確測(cè)量的頻率范圍？ · 如果效應(yīng)相互拮抗的cytokine同時(shí)產(chǎn)生，它們是否會(huì)互相妨礙？及到什么程度？
ELISPOT 技術(shù)的現(xiàn)在
1996年以來(lái)隨著抗體制備、PVDF膜材等技術(shù)改良，ELISPOT 分析技術(shù)已經(jīng)逐漸達(dá)到科研人員的期待，它已是當(dāng)世公認(rèn)最靈敏抗原特定T細(xì)胞的體外檢測(cè)技術(shù)。藉由檢驗(yàn)新鮮分離PBMC細(xì)胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術(shù)可提示T細(xì)胞免疫系統(tǒng)的兩個(gè)重要參數(shù)：抗原特定T細(xì)胞的clone族群大��；和免疫效應(yīng)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)路徑Th1/Th2。
多年來(lái)經(jīng)過(guò)數(shù)十個(gè)研究團(tuán)隊(duì)的致力研究，對(duì)于ELISPOT分析技術(shù)本身的幾個(gè)問(wèn)題，也有了科學(xué)上的驗(yàn)證。目前一般公認(rèn)，ELISPOT技術(shù)允許科研人員在單細(xì)胞水平上識(shí)別抗原特定T細(xì)胞，主要針對(duì)經(jīng)由CD4或者CD8細(xì)胞的免疫反應(yīng)。在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下，ELISPOT Cytokine 斑點(diǎn)的數(shù)量分析顯示斑點(diǎn)是由一個(gè)單細(xì)胞所生成，同時(shí)斑點(diǎn)形態(tài)學(xué)與Time Response分析則顯示斑點(diǎn)直徑大小直接反映該細(xì)胞族群的產(chǎn)能。也因?yàn)槿绱�，ELISPOT是個(gè)免疫學(xué)上的標(biāo)竿技術(shù)，它可以允許科研人員在幾乎自然生理?xiàng)l件下，觀察細(xì)胞實(shí)際分泌Cytokine的進(jìn)程，進(jìn)而可以得到藥理學(xué)信息，闡明免疫調(diào)節(jié)藥物如何影響T細(xì)胞分泌各類(lèi)cytokine的速率。藥物抑制T細(xì)胞免疫一般可通過(guò)兩程截然不同的機(jī)轉(zhuǎn)；使能分泌Cytokine的Precursor T細(xì)胞族群變小，或減少每Precursor T細(xì)胞的cytokine產(chǎn)能，而ELISPOT技術(shù)能提供雙份信息。
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上圖：典型Elispot Plate Layout 右圖：實(shí)驗(yàn)結(jié)果 | |
ELISPOT分析技術(shù)的幾個(gè)特點(diǎn)已經(jīng)讓它在抗原特定T細(xì)胞免疫學(xué)上獨(dú)占鰲頭。此技術(shù)是當(dāng)世唯一準(zhǔn)許百萬(wàn)分之一1:1000,000的準(zhǔn)確分析，如此強(qiáng)效的解析力使流式細(xì)胞技術(shù)也望其項(xiàng)背，以目前國(guó)內(nèi)外常規(guī)的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技術(shù)的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對(duì)T細(xì)胞免疫學(xué)研究是必須的，因?yàn)榭乖囟═細(xì)胞一般在機(jī)體周邊循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生的頻率通常低于萬(wàn)中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技術(shù)被證實(shí)適用于冰凍后復(fù)蘇的人類(lèi)淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離樣品有相當(dāng)?shù)男r(jià)，沒(méi)有喪失功能。這一點(diǎn)對(duì)臨床試驗(yàn)非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣，如果試驗(yàn)牽涉全國(guó)多個(gè)臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，病人血樣可冰存并同時(shí)集中在「中央實(shí)驗(yàn)室」一齊被測(cè)試。同理，一個(gè)血樣或標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品可被分裝小份，被送到不同檢驗(yàn)中心進(jìn)行測(cè)試，以交互比對(duì)，同時(shí)有利LISPOT Cytokine技術(shù)流程的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化。
流式細(xì)胞intracellular cytokine技術(shù)之靈敏度僅是萬(wàn)中取一
ELISPOT 斑點(diǎn)的判讀
像多數(shù)的Cell-based分析技術(shù)一樣，ELISPOT Cytokine技術(shù)也是相當(dāng)耗時(shí)、耗勞力的工作。事實(shí)上到目前為止，以目視法判讀少量細(xì)胞族群的特性如激活T細(xì)胞之激素分泌，仍被視為是免疫學(xué)技術(shù)上的一大挑戰(zhàn)。ELISPOT結(jié)果的判讀常需要專(zhuān)聘、有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)員才可以；有時(shí)就算有專(zhuān)職技師判讀，使用傳統(tǒng)的顯微鏡計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)仍不免會(huì)偶有主觀意見(jiàn)，而有所偏頗。
科學(xué)實(shí)證的本質(zhì)，在于如何使實(shí)驗(yàn)結(jié)果能盡可能客觀、精確、同時(shí)有高重現(xiàn)性，傳統(tǒng)的人工計(jì)算法顯然無(wú)法達(dá)到此一要求。這就是Elispot Reader酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀應(yīng)運(yùn)而生。分析ELISPOT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的過(guò)程中，Elispot Reader儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后儲(chǔ)存成TIF檔；這些影像可以進(jìn)一步使用手動(dòng)、或是自動(dòng)方式計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)目，如果使用Elispot Reader分析軟件，可以先設(shè)定條件，然后同時(shí)分析斑點(diǎn)的大小，以推估激素分泌的多寡。預(yù)料像Elispot Reader這一類(lèi)自動(dòng)圖像掃描分析儀器，將可克服傳統(tǒng)顯微鏡判讀方法耗費(fèi)人力、及人為客觀性等缺點(diǎn)，徹底解除ELISPOT分析技術(shù)的瓶頸問(wèn)題，進(jìn)一步推廣該技術(shù)的新穎應(yīng)用。
Elispot Reader可以提供不同的數(shù)據(jù)格式，包括未處理與處理過(guò)的膜表面影像、每個(gè)小孔中的斑點(diǎn)數(shù)目、每個(gè)小孔中的平均斑點(diǎn)數(shù)目、每個(gè)小孔中斑點(diǎn)大小的直方統(tǒng)計(jì)圖。
ELISPOT 未來(lái)展望
據(jù)筆者的觀察，ELISPOT 分析技術(shù)正在歐美各國(guó)發(fā)揮它的完整潛能，它讓免疫學(xué)家可以直接洞察活體內(nèi)T細(xì)胞相關(guān)生理學(xué)或病理學(xué)，就像是心臟外科醫(yī)師手上的那張心電圖，經(jīng)由這個(gè)技術(shù)科研人員可以在活體內(nèi)直接進(jìn)入一個(gè)器官系統(tǒng)，在那里視察、發(fā)掘，得到全新的智識(shí)。
從各國(guó)文獻(xiàn)可見(jiàn)ELISPOT技術(shù)已經(jīng)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的要求，并被廣泛地應(yīng)用在多項(xiàng)領(lǐng)域，包括監(jiān)視癌癥病人接受免疫療程時(shí)的反應(yīng)(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、腫瘤(Nagorsen, 2000)、或自體免疫病人體內(nèi)的一個(gè)特定的免疫反應(yīng)型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技術(shù)同時(shí)也在數(shù)個(gè)疫苗效價(jià)評(píng)估人體試驗(yàn)中，被當(dāng)成重要的終結(jié)指針。2003年1月，世界衛(wèi)生組織通過(guò)與大陸北京性艾中心合作，將應(yīng)用ELISPOT技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)HIV疫苗研究免疫應(yīng)答反應(yīng)技術(shù)，該計(jì)劃是首次利用ELISPOT技術(shù)對(duì)亞洲國(guó)家從事HIV疫苗研究和臨床試驗(yàn)的有關(guān)研究。我們期待未來(lái)此一技術(shù)能在我國(guó)免疫學(xué)界得到廣泛地應(yīng)用。
其它ELISPOT應(yīng)用范圍
· 移植研究 – allograft rejection
· 疫苗開(kāi)發(fā) -亦可評(píng)估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響
· Th0/Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換分析
· 自體免疫研究 – 免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究
· 癌癥研究 -腫瘤反應(yīng)T細(xì)胞作用
· 過(guò)敏機(jī)制探討 – IL-4誘導(dǎo)免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參與過(guò)敏機(jī)制之細(xì)胞激素研究
· 傳染疾病研究 – Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, …等
· 抗原決定位定圖
· 體液免疫力研究 – B細(xì)胞免疫球蛋白及特定亞型反應(yīng)的進(jìn)展研究
ELISPOT 應(yīng)用領(lǐng)域
- 自身免疫檢測(cè)
- 器官移植
- 疫苗和藥品的研發(fā)與檢測(cè)
- T 細(xì)胞功能研究
- 腫瘤研究
- 傳染病的研究和檢測(cè)
- 病毒研究等。
目前使用ElispotReader的部分研究領(lǐng)域如下
- 單細(xì)胞解析度/體外抗原特異性 T 細(xì)胞頻率的準(zhǔn)確測(cè)量
- 測(cè)量 1 類(lèi)和 2 類(lèi)免疫力
- T 細(xì)胞的同源性細(xì)胞因子產(chǎn)物與旁細(xì)胞因子產(chǎn)物
- 功能性 T 細(xì)胞親和力的測(cè)量
- 細(xì)胞因子協(xié)同表達(dá) / 雙色 ELISPOT
- 斑點(diǎn)尺寸分布
- PBMC的體外測(cè)量的分析到分析的重可生產(chǎn)性
- 新鮮和低溫儲(chǔ)藏后的人類(lèi)PBMC的比較
- CD 8+ T 細(xì)胞和CD8+ T 細(xì)胞和 Granzyme B 的 ELISPOT 分析
- 除了人類(lèi) PBMC 、鼠淋巴結(jié)/脾臟細(xì)胞以外的細(xì)胞的 ELISPOT 分析
- 免疫與佐藥
- 腫瘤免疫
- 移植免疫
ELISPOT 技術(shù)優(yōu)勢(shì)
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圖注：ELISPOT 法在檢測(cè)低頻率產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞時(shí)具有獨(dú)一無(wú)二的敏感性。將指定數(shù)目的能產(chǎn)生 IFN- 的T細(xì)胞與一百萬(wàn)個(gè)抗原呈現(xiàn)細(xì)胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上圖）、胞質(zhì)內(nèi)染法（中圖）和 ELISA 法（下圖）分別測(cè)量產(chǎn)生 IFN- 的細(xì)胞的數(shù)目。 ELISPOT 分析使單細(xì)胞分泌產(chǎn)物可視化。這些分析異常敏感，因?yàn)樗窃谥苯釉诜置诩?xì)胞的周?chē)M(jìn)行捕捉，而且是在表面被沖淡，或者被臨近的細(xì)胞上的受體捕獲，或降解之前。
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- 最低至1：100萬(wàn)細(xì)胞精度的活體外頻率測(cè)量。這種分辨率已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)使用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的四聚物染色和 ELISA 法測(cè)量的精度。這種高敏感度是非常關(guān)鍵的，因?yàn)榭乖禺愋?FONT face="Times New Roman"> T 細(xì)胞在體外都是典型性的低頻率。
- 高產(chǎn)量 T 細(xì)胞分析成為可行。一個(gè)經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室小組可以測(cè)試成百的樣本中幾十種抗原的反應(yīng)。
- 只需要少量細(xì)胞，就可以用于通其他細(xì)胞學(xué)分析方法進(jìn)行比較。例如，45毫升的血液就足以用于測(cè)試600種不同抗原/肽類(lèi)物質(zhì)的反應(yīng)。
- 可以定義CD4和CD8細(xì)胞的免疫因子指標(biāo)。這是因?yàn)橹恍枰贁?shù)細(xì)胞，分析就可以在高產(chǎn)量模式下進(jìn)行。ELISPOT 分析在篩選肽庫(kù)，繪制免疫因子方面是一個(gè)理想的工具。
- 用于確定抗原特異性 T 細(xì)胞的功能性親和力。這最大可能受到肽類(lèi)藥物刺激至50%的影響。
- 可以用于研究未經(jīng)藥物處理過(guò)的細(xì)胞的分泌過(guò)程。如果觀察到凈產(chǎn)量減少，可以確定這種區(qū)別是來(lái)自于分泌細(xì)胞的減少，還是每個(gè)細(xì)胞分泌產(chǎn)量的減少。
- 淋巴細(xì)胞在 ELISPOT 分析后依然存活。這使得分析之后進(jìn)行增值，用于更進(jìn)一步的分析、克隆或者低溫儲(chǔ)藏成為可能。
- 低溫儲(chǔ)藏后的人類(lèi)淋巴細(xì)胞可以用于檢測(cè)，而不會(huì)丟失其功能。治療前和治療后的樣本可以并排進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果可以重復(fù)。
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