多元數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法分析傳統(tǒng)草藥，使用UPLC 超高效液相色譜/TOF-MS飛行時(shí)間質(zhì)譜比較不同樣品種類

Kate Yu, Jose Castro-Perez, 和 John Shockcor
沃特世公司，米爾福德，馬薩諸塞州，美國(guó)

前言
傳統(tǒng)草藥 (THM）或傳統(tǒng)中藥 (TCM）樣品的分析研究是非常具有挑戰(zhàn)性的，直接原因是樣品的重現(xiàn)性差。植物提取物的成分會(huì)因產(chǎn)地，采收季節(jié)以及提取方法的不同而發(fā)生顯著變化。即使提取物是來自同一株植物的提取物或來自相同名稱的兩株植物，其成分也不盡相同。

此外，為了有效的對(duì)中藥進(jìn)行質(zhì)量控制，非常有必要對(duì)中草藥進(jìn)行分析比較。中草藥樣品分析對(duì)于傳統(tǒng)草藥的生理作用機(jī)理的研究也是非常關(guān)鍵的。

我們開發(fā)了一套簡(jiǎn)便快速且易于通用的傳統(tǒng)中草藥分析流程的(圖 1)。該分析流程利用了沃特世(Waters®) UPLC® 超高效液相色譜的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，即高分辨，高靈敏度和快速分離，并結(jié)合了 SYNAPT™ HDMS™ 質(zhì)譜系統(tǒng)的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOF MS)精確質(zhì)量數(shù)測(cè)定的功能。該工作流程能夠應(yīng)用于化合物鑒定或樣品解析。

傳統(tǒng)中草藥中的化合物鑒定在我們已在另一篇應(yīng)用紀(jì)要中討論過。1 本文將演示如何利用該分析流程借助多元數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)的解析。結(jié)果表明，樣品的比較可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成并獲得完整的樣品信息。這顯著地縮短了傳統(tǒng)草藥樣品的分析時(shí)間和節(jié)省了人力。

圖 1. 傳統(tǒng)草藥分析的工作流程。

實(shí)驗(yàn)方法
本實(shí)驗(yàn)的樣品來自于兩種人參提取物口服液。
樣品 1 是人參精口服液 (產(chǎn)自中國(guó)，JV Trading Ltd. 公司銷售，紐約，紐約州)。
樣品 2 是青春寶口服液 (產(chǎn)自中國(guó)，Overseas Factor Corporation 公司銷售，舊金山，加利福尼亞州)。
每個(gè)樣品在進(jìn)樣前先過濾。

液相條件
液相系統(tǒng): 沃特世 ACQUITY UPLC® 超高效液相色譜系統(tǒng)
色譜柱: ACQUITY UPLC 超高效液相色譜 HSS T3 色譜柱
2.1 x 100 mm, 1.7 μm, 65 °C
流速: 600 μL/min
流動(dòng)相 A: 水+ 0.1% 甲酸
流動(dòng)相 B: 甲醇

梯度 :	時(shí)間	組成	曲線
/	0 min	95% A	/
/	10 min	30% A	Curve 6
/	17 min	0% A	Curve 6
/	20 min	95% A	Curve 1

質(zhì)譜條件
質(zhì)譜系統(tǒng): 沃特世 SYNAPT HDMS 質(zhì)譜系統(tǒng)
離子化模式: 電噴霧
毛細(xì)管電壓: 3000 V
錐孔電壓: 35 V
除溶劑溫度: 450 °C
除溶劑氣體: 800 L/Hr
離子源溫度: 120 °C
采集范圍: 50 to 1500 m/z
碰撞氣體: 氬氣

數(shù)據(jù)處理
化合物篩選和分析: MarkerLynxTM
應(yīng)用管理軟件
多元數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析: SIMPCA-P

結(jié)果
為保證數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的可靠性和重要性，每個(gè)樣品至少重復(fù)進(jìn)樣三次。為獲得每個(gè)樣品的所有信息，有必要對(duì)它們?cè)谡��?fù)離子模式下進(jìn)行LC/MS分析。本實(shí)驗(yàn)中，每種樣品重復(fù)進(jìn)樣六次:三次電噴霧正離子模式分析和三次電噴霧負(fù)離子模式分析。出于演示目的，本文只討論了負(fù)離子模式下的結(jié)果。

圖 2 顯示兩種人參提取物口服液基峰離子色譜圖的比較。由圖可以看出人參精口服液含成份遠(yuǎn)多于青春寶并且濃度更高。由于兩個(gè)樣品成份都很復(fù)雜，有必要利用多元數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)
工具對(duì)兩個(gè)樣品做進(jìn)一步的分析。

圖 2. 兩種人參提取物樣品的 LC/MS 液相色譜/質(zhì)譜基峰離子色譜圖。

使用多元數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法對(duì) LC/MS 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的第一步是將三維 LC/MS 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成二維矩陣。這一關(guān)鍵步驟由 MassLynx™操作軟件中的 MarkerLynx 完成。MarkerLynx 將每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)轉(zhuǎn)換成精確質(zhì)量保留時(shí)間 (EMRT) 數(shù)據(jù)對(duì)，并以二維矩陣型式將結(jié)果列出 (圖 3)。

本實(shí)驗(yàn)共得到了 1184 個(gè)精確質(zhì)量保留時(shí)間 (EMRT) 數(shù)據(jù)對(duì) �？蓹z測(cè)到 EMRT 數(shù)據(jù)對(duì)的數(shù)量取決于色譜峰檢測(cè)限的設(shè)定，該參數(shù)可由分析人員設(shè)定。

圖 3. MarkerLynx 結(jié)果顯示窗口。窗口上部為樣品進(jìn)樣列表。窗口下部為精確質(zhì)量于保留時(shí)間數(shù)據(jù)對(duì)列表。

從 MarkerLynx 報(bào)告界面上，僅需點(diǎn)擊 P+ 按鈕，EMRT 數(shù)據(jù)對(duì)列表就可以被自動(dòng)導(dǎo)入到 SIMCA-P 中。首先利用主成分分析 (PCA) 法對(duì)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。之后利用無監(jiān)督統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，結(jié)合正交偏最小二乘法進(jìn)行兩維數(shù)據(jù)分析 (OPLS-DA)。

圖 4 列出正交偏最小二乘法數(shù)據(jù)分析的分值結(jié)果。該圖清晰地展示了兩個(gè)樣品組在 X 軸和 Y 軸方向的差別。

圖 4. 數(shù)值圖表示人參精口服液和青春寶口服液明顯的分組情況。

為進(jìn)一步鑒定兩組樣品的化學(xué)組成上的差異性，正交偏最小二乘法得到的數(shù)據(jù)分析結(jié)果散點(diǎn)圖如圖 5 所示。

圖 5. 基于正交偏最小二乘法獲得的人參精口服液和青春寶口服液數(shù)據(jù)分析結(jié)果散點(diǎn)圖。

在散點(diǎn)圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)精確質(zhì)量保留時(shí)間數(shù)據(jù)對(duì)。X軸表示可變量。一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)距離 0 越遠(yuǎn)，該點(diǎn)對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)越大。Y 軸表示在同一樣品組中的樣品間的相關(guān)性。精確質(zhì)量與保留時(shí)間數(shù)據(jù)對(duì)距離 0 值越遠(yuǎn)，進(jìn)樣間的相關(guān)性越好。因此，在 S 型曲線兩端的 EMRT 數(shù)據(jù)對(duì)代表了來自每個(gè)樣品組的可信度最高的特征離子。

例如，圖 5 中，接近 S 圖右上角的 EMRT 數(shù)據(jù)對(duì)為來自青春寶口服液可信度最強(qiáng)的特征標(biāo)記物，接近 S 圖左下角的 EMRT數(shù)據(jù)對(duì)為來自人參精口服液可信度最強(qiáng)的特征標(biāo)記物。這些特征的 EMRT 數(shù)據(jù)對(duì)可以被選擇性地捕獲，并獲得每組樣品中特征標(biāo)記物列表，并以 TXT 文件保存下來。這個(gè) TXT文件可被輸回 MarkerLynx ，產(chǎn)生一個(gè)結(jié)果列表，從而用于元素組成搜索以及數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。圖 6 顯示了從兩組樣品 S 圖中獲得的十個(gè)特征的精確質(zhì)量與保留時(shí)間數(shù)據(jù)對(duì)列表。

圖 6. 利用正交偏最小二乘法從兩個(gè)樣品數(shù)據(jù)分析散點(diǎn)圖中獲得的最高貢獻(xiàn)的十個(gè)精確質(zhì)量保留時(shí)間數(shù)據(jù)對(duì)列表。

圖 6 表明保留時(shí)間為 6.45 分鐘質(zhì)荷比為 945.5419 離子是人參精樣品中最顯著的標(biāo)記物，可信度達(dá) 0.999。保留時(shí)間為6.33 分鐘質(zhì)荷比為 801.5021 的離子是青春寶樣品中最顯著
的標(biāo)記物，可信度達(dá) 0.994。

此外，相比人參精樣品(從質(zhì)荷比 783 到質(zhì)荷比1187)，青春寶樣品中最特征的十個(gè) EMRT 數(shù)據(jù)對(duì)在較低的分子量范圍內(nèi)(從質(zhì)荷比 623 到質(zhì)荷比 955)。這說明人參精樣品的十個(gè)特
征的標(biāo)記物中的大多數(shù)含有三至四個(gè)糖環(huán)，而青春寶樣品中最特征的十個(gè)標(biāo)記物含有二至三個(gè)糖環(huán)。差異性最大的十個(gè) EMRT 數(shù)據(jù)對(duì)也可以用棒狀圖格式進(jìn)行查看。圖 7 列出人參精 (7a) 和青春寶 (7b) 十個(gè)差異性最大的標(biāo)記物的棒狀圖。

圖 7. 人參精 (7a)和青春寶(7b)十個(gè)差異性最大的標(biāo)記物的棒狀圖。

棒狀圖提供了列表中已經(jīng)鑒定的標(biāo)記物的額外信息，顯示被研究的兩個(gè)樣品組十個(gè)差異性最大的 EMRT 數(shù)據(jù)對(duì)的直接比較結(jié)果。在圖 7 中，人參精樣品的十個(gè)特征標(biāo)記物在青春寶樣品中幾乎沒有被檢測(cè)到。而來自青春寶樣品的十個(gè)特征標(biāo)記物在人參精樣品中被檢測(cè)到具有很低的強(qiáng)度，有些也未能檢測(cè)到。

此外，棒狀圖也提供了一些半定量的信息。來自青春寶樣品的十個(gè)最大標(biāo)記物比在人參精樣品中檢測(cè)到的強(qiáng)度高。表明青春寶口服液是比人參精口服液更純的提取物。

如上所述，從 SIMCA-P 得到的文本文檔可以直接導(dǎo)入 MarkerLynx結(jié)果列表中。圖 8 顯示填入兩組結(jié)果的 MarkerLynx 結(jié)果窗口界面，每個(gè)表格代表一組。

圖 8. 導(dǎo)入精確質(zhì)量與保留時(shí)間數(shù)據(jù)對(duì)的 MarkerLynx 結(jié)果顯示窗口界面，文本文檔從 SIMCA-P 散點(diǎn)圖獲得。

從 MarkerLynx 結(jié)果表格中，可以對(duì)每一個(gè) EMRT 數(shù)據(jù)對(duì)報(bào)告中的精確質(zhì)量進(jìn)行元素組成分析檢索。此信息可進(jìn)一步用于作現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)搜查，尋找推斷的該成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)(如果數(shù)據(jù)庫(kù)中存在該種標(biāo)記物)。

舉例來說，我們從青春寶樣品中選擇一個(gè)質(zhì)荷比為 971.4880的標(biāo)記物，其元素組成為 C48H76O20，對(duì)公共平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)，Chemspider 進(jìn)行檢索。其中一個(gè)可能性如圖 9 所示。

圖 9. Chemspider 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索的到的質(zhì)荷比 971.4880 的可能結(jié)構(gòu)。

從該信息很容易返回到液相色譜/質(zhì)譜 LC/MS 原始數(shù)據(jù)，利用飛行時(shí)間 TOF MSE 數(shù)據(jù)1的碎片離子來確認(rèn)推導(dǎo)的結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。

結(jié)論
本應(yīng)用文集演示一種通用智能化的傳統(tǒng)中草藥樣品分析的工作流程。相對(duì)于傳統(tǒng)的分析方法，當(dāng)前這種方法對(duì)于相當(dāng)復(fù)雜樣品的分析非常有效。通過 UPLC® 超高效液相色譜/SYNAPT™ HDMS™ 質(zhì)譜系統(tǒng)的進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，首先采集含有精確質(zhì)量測(cè)定的原始數(shù)據(jù)。當(dāng)將這些數(shù)據(jù)作為精確質(zhì)量保留時(shí)間數(shù)據(jù)對(duì)轉(zhuǎn)成二維矩陣形式，多元數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析方法即可對(duì)這套數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。每個(gè)樣品的最特征的離子可以從 SIMCA-P 的正交偏最小二乘法數(shù)據(jù)分析散點(diǎn)圖中獲得。結(jié)果可以導(dǎo)回 Markerlynx 的結(jié)果列表中。如果標(biāo)記物是已經(jīng)解析出的化合物，可利用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索其元素組成及化學(xué)結(jié)構(gòu)。整套分析方法簡(jiǎn)便，快速適用性強(qiáng)。它可以很方便地應(yīng)用到不同類型的傳統(tǒng)中草藥樣品分析之中。因此，在顯著節(jié)省資源的同時(shí)獲得最大信息量。

參考文獻(xiàn)
1. An Intelligent Workflow for Traditional Herbal Medicine: Compound Identification by UPLC/TOF MS. Yu K, Castro-Perez J, Shockcor J. Waters Application Note. 2008; 720002486EN.

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