實(shí)時(shí)熒光定量PCR在人感染豬流感診斷中的作用

彭年才¹²  張鎮(zhèn)西¹  蘭鄒然³  黃兵³  李紅東²  李明²   苗保剛²

¹西安交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)分析技術(shù)與儀器研究所 ²西安天隆科技有限公司 ³山東省動(dòng)物疾病預(yù)防與控制中心

2009年4月30日

摘要：病原檢測(cè)方法及儀器是人感染豬流感防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，針對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子診斷核酸檢測(cè)技術(shù)的先進(jìn)性以及國產(chǎn)試劑和儀器的成熟性，本文分析了該技術(shù)在以往禽流感檢測(cè)被采用的國家標(biāo)準(zhǔn)以及使用的廣泛性，最后介紹了最新發(fā)布的美國CDC《針對(duì)人感染豬流感病毒治療和預(yù)防的臨時(shí)指南》和我國衛(wèi)生部《人感染豬流感預(yù)防控制技術(shù)指南（試行）》，兩部法規(guī)都將實(shí)時(shí)熒光定量PCR確定為人感染豬流感實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的確診方法。從以上情況可以獲知：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在人感染豬流感診斷中具有先進(jìn)、快速、成熟、合法的特點(diǎn)，是一種法定的主流技術(shù)，將來實(shí)施中，國產(chǎn)化儀器和試劑都有保障。

關(guān)鍵詞：人感染豬流感  豬流感診斷  快速檢測(cè)  實(shí)時(shí)定量PCR  Real-time RT-PCR

全球性的人感染豬流感公共衛(wèi)生事件發(fā)展勢(shì)頭迅猛，發(fā)生國家眾多，世界衛(wèi)生組織29日晚已將全球流感大流行警告級(jí)別從4級(jí)提高到5級(jí)，我國也于28日召開了國務(wù)院常務(wù)會(huì)議對(duì)防控進(jìn)行了部署�，F(xiàn)在已進(jìn)入關(guān)鍵的防控措施落實(shí)階段，其中檢測(cè)與診斷技術(shù)至關(guān)重要。

眾所周知，雖雖然本次人感染豬流感事件的病毒基因序列還在進(jìn)一步確立當(dāng)中，但本次疫情病原學(xué)基礎(chǔ)明確，屬于RNA病毒感染性疾病�；仡櫧�年來感染RNA病毒的烈性傳染病，如SARS、禽流感，世界衛(wèi)生組織及我國衛(wèi)生行政和技術(shù)部門相繼制定了較為成熟的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中我國頒布的應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和快速診斷的標(biāo)準(zhǔn)如《GB/T 19438.1—2004禽流感病毒通用熒光RT—PCR檢測(cè)方法》、《GB/T 19438.2—2004 H5亞型禽流感病毒熒光RT—PCR檢測(cè)方法》、《GB/T 19438.3—2004 H7亞型禽流感病毒熒光RT—PCR檢測(cè)方法》等，同時(shí)我們也注意到近年來國家針對(duì)食品安全尤其是乳品檢測(cè)和食物致病菌檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，如《SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎腸桿菌檢驗(yàn)方法：熒光PCR方法》和《SN/T 1870-2007 食品中致病菌檢測(cè)方法：實(shí)時(shí)PCR法》。以上實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在禽流感及其它方面檢測(cè)的國家標(biāo)準(zhǔn)是該技術(shù)在當(dāng)前的人感染豬流感診斷中應(yīng)用的基礎(chǔ)和前提。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡(jiǎn)稱Real Time PCR，如果用于RNA檢測(cè)，這被稱為逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR即Real-time RT-PCR）是實(shí)時(shí)PCR法，它是指對(duì)DNA或經(jīng)過反轉(zhuǎn)入（RT-PCR）的RNA通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA的放大過程，在擴(kuò)增的指數(shù)增長期就測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物，因?yàn)閿U(kuò)增指數(shù)增長期測(cè)量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關(guān)性，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。Real Time PCR的基本目標(biāo)是精確測(cè)量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監(jiān)測(cè)CT值而實(shí)現(xiàn)對(duì)原始目標(biāo)基因的含量定量。目前被普遍使用的多種常規(guī)PCR方法如各種凝膠電泳PCR法，終點(diǎn)熒光定量法或PCR-ELISA法叫做終點(diǎn)PCR法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法最大的優(yōu)點(diǎn)是克服了終點(diǎn)PCR法進(jìn)入平臺(tái)期或叫飽和期后定量的較大誤差，實(shí)現(xiàn)DNA/RNA的精確定量。普通PCR技術(shù)發(fā)明于1983年，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)發(fā)明于上世紀(jì)九十年代并于1996年生產(chǎn)出了世界上第一臺(tái)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)的技術(shù)要素主要有熒光定量PCR試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，我國熒光定量PCR試劑盒研發(fā)實(shí)力強(qiáng)大，生產(chǎn)廠家較多，臨床診斷的品種如HBV/HCV及禽流感診斷試劑盒性能優(yōu)良、供應(yīng)充足，基本實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化。在豬流感病毒RNA核酸序列明確的情況下，利用現(xiàn)有的試劑研發(fā)平臺(tái)，人感染豬流感實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷試劑盒很快就會(huì)面世。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀由于技術(shù)含量高，只有少數(shù)幾家中國企業(yè)有能力生產(chǎn)如西安天隆科技有限公司生產(chǎn)的TL-988系列儀器不但取得了發(fā)明專利、國家科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)、國家重點(diǎn)新產(chǎn)品證書、醫(yī)療器械注冊(cè)證，而且被國家發(fā)改委確立為國家高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范工程2008年生物醫(yī)學(xué)工程專項(xiàng)，產(chǎn)品性能達(dá)到國際先進(jìn)水平，在乳品檢測(cè)行業(yè)市場(chǎng)占有率比進(jìn)口儀器還高^[1-3]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀應(yīng)用廣泛，1999年開始，西方發(fā)達(dá)國家嘗試將PCR應(yīng)用于臨床傳染病診斷、食品安全檢測(cè)以及血液篩查，目前已相當(dāng)普及。2008年12月13日中國衛(wèi)生部下發(fā)《衛(wèi)生應(yīng)急隊(duì)伍裝備參考目錄》（衛(wèi)辦應(yīng)急發(fā)[2008]207號(hào)），其中要求縣級(jí)以上衛(wèi)生應(yīng)急隊(duì)伍建設(shè)中必須配備PCR儀和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀作為傳染病控制類裝備。

在人感染豬流感病毒出現(xiàn)以前，針對(duì)豬與豬傳染的傳統(tǒng)豬流感疫情，近年來我國科技人員經(jīng)過不懈努力，探索快速檢測(cè)與診斷方法，發(fā)表了一系列應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的研究論文^[4-5]。

人感染豬流感疫情發(fā)生后，美國疾病預(yù)防控制中心（CDC）于2009年4月28日發(fā)布了針對(duì)人感染豬流感病毒治療和預(yù)防臨時(shí)指南，西安天隆科技有限公司在第一時(shí)間將其翻譯成中文版本^[6]。其中規(guī)定了確診病例的診斷方法：具有急性發(fā)燒呼吸道疾病的臨床癥狀并且經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time RT-PCR)或病毒分離培養(yǎng) (viral culture)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法檢驗(yàn)證實(shí)感染A（H1N1）型豬流感病毒。衛(wèi)生部辦公廳于4月30日印發(fā)了《人感染豬流感預(yù)防控制技術(shù)指南（試行）》的通知》^[7]，其中在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和病例診斷報(bào)告章節(jié)，內(nèi)容如下：

呼吸道標(biāo)本應(yīng)首先應(yīng)用real time RT-PCR方法檢測(cè)A型流感病毒的M基因、Swine（ H1N1）的HA基因和NP基因，以及質(zhì)控對(duì)照RNP基因。同時(shí)，接種MDCK細(xì)胞或SPF雞胚進(jìn)行病毒分離，并測(cè)定病毒的全基因組序列。

 推薦檢測(cè)方法

用Real-time RT-PCR方法檢測(cè)豬流行性感冒（ H1N1病毒）病毒。

 其他檢測(cè)方法 
快速流感抗原檢測(cè)

病毒培養(yǎng)

免疫熒光法（或裝配的IFA ）

顯然，上述衛(wèi)生部法規(guī)中，與“其他檢測(cè)方法”不同，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法被法定為人感染豬流感診斷的推薦檢測(cè)方法。

1. Nian-cai Peng（彭年才）, Chun-lin Wang ,Li-li Zhang ,Miao-lin Lu ,Zhen-xi Zhang: Asymmetric PCR method in generation of HBV ssDNA for pyrosequencing, Academic Journal of Xi’an Jiaotong University,VOL.21 No.1,Feb 2009，54-56

2. 彭年才，張鎮(zhèn)西，李明：乳制品中阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)，食品安全導(dǎo)刊，08.7：96-100

3. 彭年才，蘇明權(quán)，張鎮(zhèn)西：乳品檢測(cè)中實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的研制，中國乳品工業(yè)，200705：62-64

4. 段廷云，陳紅英，崔保安等：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)H1N1亞型豬流感病毒，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008。39（6）：752-756

5. 張春明，喬傳玲，陳艷等，豬流感病毒M基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR診斷方法的建立，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008。20（10）：805-809

6. 美國CDC針對(duì)人感染豬流感病毒治療和預(yù)防的臨時(shí)指南（中英文全文）

7.中國衛(wèi)生部：人感染豬流感預(yù)防控制技術(shù)指南（試行）