現(xiàn)代高效液相色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇中。但是色譜填料的選責(zé)范圍很寬，要做合適的選擇，必須對此有一定的認(rèn)識和了解。

1，  1，  正相色譜

正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica），以及其他具有極性官能團(tuán)，如胺基團(tuán)

(ZH₂,APS)和氰基團(tuán)（CN，CPS）的鍵合相填料。

 由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他團(tuán)的極性教強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中的各組份的極性大小，即極性強(qiáng)落的組份最先被沖洗出色譜柱。

正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯（Chloroform） 二氯甲烷（Methylence  Chloride）等.

2反相色譜

反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，表面鍵合有極性相對教弱的官能團(tuán)的鍵合相。

反相色譜所使用的流動相極性教強(qiáng)，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。

樣品流出色譜柱的順序是極性教強(qiáng)組合最先被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。

常用的反相填料有C18（ODS） C8（MOS）。C4（B）C₆H₅（Phenyl）等。

聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸至等，其主要優(yōu)點(diǎn)是在PG值為1-14均可使用。

相對與硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強(qiáng)的淑水性；大孔的聚合物填料對蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。

現(xiàn)在的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效教低。

其它HPLC的無機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化。由于其特殊的性質(zhì)，一般僅限于特殊的用途。如墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)，石墨化碳可用于分離某些幾何導(dǎo)構(gòu)體，又由于HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可在PH高達(dá)12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應(yīng)用，新型氧化誥填料也可用于       HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化誥微球色譜柱，應(yīng)用PH范圍1~14，溫度可達(dá)到100⁰C。由于氧化誥填料幾年才開始研究，加之前的實驗難度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進(jìn)行中。

目前，商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3,5和10um填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料應(yīng)用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。如果固定相選擇是真確，但是分離度不夠，那么選擇更小粒度的填料是很用有的，3um填料填充柱的柱數(shù)比相同條件下的5UM填料的柱效提高近30%；然而；3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更短的色譜柱，以縮短分析時間，另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。

ü       ü       認(rèn)證閱讀色譜柱使用說明書

ü       ü       使用填充良好的色譜柱；

ü       ü       盡量減少壓力波動，避免機(jī)械及熱沖擊

ü       ü       使用保護(hù)柱及在線過濾器

ü       ü       經(jīng)常以強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱

ü       ü       充分過濾樣品及流動相，盡量避免雜質(zhì)微粒與保強(qiáng)留分成

ü       ü       用穩(wěn)定的固定相（C18最穩(wěn)定）

ü       ü       在中等PH紙操作（6~8），用有機(jī)年成液溶；

ü       ü       色譜柱使用溫度最好小于40⁰C

ü       ü       硅膠基質(zhì)的的色譜柱，應(yīng)保持流動相的PH值范圍在3.0~8.0

ü       ü       在水流動相與緩沖濃液中加200ppm的疊氮鈉

ü       ü       流動相中含有緩沖溶液，應(yīng)注意應(yīng)95∶5的水及有機(jī)溶劑過渡，有機(jī)溶劑不能低于5%

ü       ü       過夜或儲存時，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機(jī)溶劑流動相保存（乙晴最好）.。

HPLC固定相及應(yīng)用范圍、

 

姓名   性別    功能基團(tuán)     正相  反相  離子對      應(yīng)用

Silica           -OH           √                非極性和中等極性以及非離子性有機(jī)化合物。

SAS     C1     -(CH₃)₃            √            在所有的烷基鍵合相中對非極性化合物保留最弱，典型用于中等極性和多官能團(tuán)化合物

Buty1   C4      -C₄H₉             √      √       分離肽和蛋白質(zhì)，保留時間比C8和C18短

MOS    C8      -C₄H₉             √     √        中等極性相中對中等化合物，小肽和蛋白質(zhì)，極性藥，0族化合物和環(huán)境樣品

ODS    C18，O                    √     √       烷基鍵合相中對中等極性化合物保留最強(qiáng)。廣泛用于藥物，0族化合物，脂肪酸和環(huán)境樣品

CPS   CN ，C              √   √               對極性化合物有獨(dú)特的選擇性，適合應(yīng)用于正相分離，當(dāng)用于反相系統(tǒng)時，其選擇性與C8和C18不同，在藥學(xué)領(lǐng)域和復(fù)雜混合物的分離中應(yīng)用廣泛。

APS     NH             √     √                     反相中分析糖類和其他極性化合物。弱陰離子交換，陰離子和有機(jī)酸則應(yīng)用緩沖劑和機(jī)改性劑做流動相，正相中與硅膠的選擇性不同，分析芳香族效果很好

                                                 芳香族化合物

PD                                              反向時，分離胎和蛋白質(zhì)。正相時，與硅選擇性相似

SCX  強(qiáng)陽離子交換                                          有機(jī)堿

SAX   強(qiáng)陰離子交換                                     有機(jī)酸，核苷和核苷酸

如何解決色譜柱使用過程中出現(xiàn)的問題

一．一．保留值與分離度重現(xiàn)性不好原因分析

 

問題                 原因                         表現(xiàn)

不同色譜柱間差異使用期間柱的變化             填料，鍵合相不同柱床破壞鍵合相丟失硅膠基質(zhì)溶解，強(qiáng)保留分堆積堵塞               保留因子（K）分離子（）柱效（N）

                                             保留因子（K）柱效（N）

柱外效應(yīng)                                     系統(tǒng)差易，進(jìn)樣量大，進(jìn)樣0與色譜柱之間，色譜柱與檢測器之間管路太長，檢測器流通池體積大，接頭死體積大等         注效（N）

分離效果變差      流動相組分改變            保留因子（K）柱效變化很小

                  流速改變                  保留因子（K）  分離因子

                  溫度改變                  保留因子（K）柱效變化很小

柱平衡慢         重新平衡時間不夠           保留因子（K）柱效變化很小

柱超載           樣品量太大                 保留因子（K）  注效（N）

二 、造成色譜峰（不對稱）拖尾的原因

1.色譜柱本身填裝問題，筷板堵塞或填料塌陷  

2.柱頭有污染；

3樣本超載；

4樣品溶劑不合適]

5.柱外效應(yīng)

6化學(xué)或二次保留（硅基）效應(yīng)

7緩沖容量不足或不合適

8重金屬污染

三、如何解決峰形拖尾的問題

A.   與化學(xué)有關(guān)的拖尾問題

1  .流動相中，加入30MM的三乙胺（用與堿性化合物）或醋酸胺（用與酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺

2如然拖尾，將三乙胺換為二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；

3.降低進(jìn)樣量至〈1UG。

B．與色譜柱有管的拖尾問題

1如柱頭處有強(qiáng)保留的樣品組分積聚，反相柱可用20倍柱體積的96%的二碌甲烷與4%甲醇，家1%氫氧化銨混合液沖洗，正向柱可用甲醇沖洗。

2.使用保護(hù)柱

C.與HPLC 系統(tǒng)有關(guān)的蜂拖尾和峰加寬

1.進(jìn)樣體積過大，通�！�25UL〉

2.進(jìn)樣0與色譜柱及檢測器之間的管路體積過大（最佳連接管應(yīng)〈20CM，內(nèi)徑為0.007〉

3檢測器流通池的體積過大

四、如何儲存色譜柱

1防止緩沖溶液和水溶液流動相產(chǎn)生微生物，做到流動相用多少配多少，或在水流動相中加200PPM的疊0鈉以抑制細(xì)菌成長（一定當(dāng)心其毒性和潛在的爆炸性）；或在流動相中家20%的有機(jī)改性劑，也可抑制微生物生長，有機(jī)改性劑還有助于流動相脫氣。

2.盡可能將色譜柱儲存于100%有機(jī)溶劑（乙晴最好）中，避免在緩沖溶液中保存。

3.使用緩沖溶液后的色譜柱，應(yīng)用15`20陪柱體積的不含緩沖劑的同種水—有機(jī)溶劑流動相沖洗色譜柱，后換成100%有機(jī)溶劑儲存。

4避免用純凈水沖洗鍵合致密的C18柱。

5將色譜柱的兩端用堵有擰好，以免柱床填料干裂。

五、如何選擇保護(hù)柱

  怎樣選擇保護(hù)柱，但又不能影響分離分析？這是色譜工作者經(jīng)常提出的一 個問題。通常，在選擇保護(hù)柱之前首先要考慮的是樣品是否清潔。對于大部分分析工作者來說，一只1CM

長的保護(hù)柱，那么就應(yīng)選擇2CM或3CM長的保護(hù)柱，保護(hù)柱越長，自然所裝添的色譜柱的機(jī)會。當(dāng)然，隨著保護(hù)柱的長度加長，樣品的保留時間會比使用短保護(hù)柱長。一般來說，保護(hù)柱的內(nèi)徑與分析色譜柱的內(nèi)徑相同或相當(dāng)即可。

  保護(hù)柱的填料裝填方式也很重要。目前有薄膜裝填法的保護(hù)柱，使用過程很簡單方便，而且可以在實驗室中進(jìn)行干裝。但是，其最大的缺點(diǎn)是不經(jīng)濟(jì)，特別是針對中國的具體情況，一次性使用相對費(fèi)用較高。另外，薄膜裝填法的保護(hù)拄所裝填的色譜填料有限，只能提供有限的保護(hù)作用。不過也因為所裝填的色譜料較少，保護(hù)柱的長度也教短，所以對分析樣品的保留時間的影響也很小。

另一種保護(hù)柱結(jié)構(gòu)其實質(zhì)是縮短了的色譜分析拄，設(shè)計方式上有直連式、手緊式或整替式。整體式設(shè)計是有色譜的生產(chǎn)廠商直接安裝在色譜分析柱上的，必須與色譜分析柱一同訂貨，可以非常方便地使用，但不能夠被修改。直連式結(jié)構(gòu)設(shè)計可在任何時候有色譜工作著來安裝連接，可以與任何品牌的色譜分析柱連接使用，而且還可以根據(jù)樣品的相關(guān)情況選擇不同的保護(hù)柱長度。手上緊即可。另外從保護(hù)柱結(jié)構(gòu)又分為是否可以更換保護(hù)柱柱芯，可以降低保護(hù)柱的使用成本。

大多數(shù)人是根據(jù)色譜分析柱的填料選擇保護(hù)柱的填料，正常情況下可以選擇與分析色譜柱一樣的色譜填料。但是，根據(jù)實際是分析工作，也可不必與分析色譜的 填料完全相匹配。

  對于選擇保護(hù)柱的原則是；在滿足分析分離要求的前提條件，盡可能的選擇較短的保護(hù)柱結(jié)構(gòu)。盡可能選擇對分離樣品小一些保留性的填料。