細(xì)胞核與線粒體的分級(jí)分離

瀏覽次數(shù)：6747　發(fā)布日期：2009-2-3　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

一、原理

細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的比重和大小都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來(lái)。

分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行分離，其過(guò)程包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分離和分析三步，這種方法已成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。

勻漿(Homogenization)低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(zhì)(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣)進(jìn)行破碎細(xì)胞使之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。

分級(jí)分離(Fractionation)由低速到高速離心逐漸沉降。先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉淀下來(lái)，從而使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體等得以分離。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開(kāi)始時(shí)均勻分布在整個(gè)離心管中，所以每級(jí)離心得到的第一次沈淀必然不是純的最重的顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化。

分析分級(jí)分離得到的組分，可用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。

二、細(xì)胞核的分離提取

(一)操作步驟

1．用頸椎脫位的方法處死小白鼠后，迅速剖開(kāi)腹部取出肝臟，剪成小塊(去除結(jié)締組織)盡快置于盛有0.9％NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。

2．將濕重約1g的肝組織放在小平皿中，用量筒量取8ml預(yù)冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝組織后，再全部加入。

3．剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨3～5次，用3層紗布過(guò)濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片①，做好標(biāo)記，自然干燥。

4．將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機(jī)，以2500rpm，離心15分鐘；(1)緩緩取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待分離線粒體用；(2)同時(shí)涂一張上清液片②做好標(biāo)記，自然干燥；(3)余下的沉淀物進(jìn)行下一步驟。

5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以2500rpm離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，涂片③，自然干燥。

6．將①、②、③涂片用l％甲苯胺蘭染色后蓋片即可觀察。

(二)結(jié)果

分別于高倍鏡下觀察三張涂片，描述鏡下所見(jiàn)。

三、高速離心分離提取線粒體

(一)操作步驟

1．將裝有上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000rpm離心20分鐘，棄上清，留取沉淀物。

2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化鈣液lml，用吸管吹打成懸液，以17000rpm離心20分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液混勻成懸液(可用牙簽)。

3．取上清液和沉淀物懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上(分別標(biāo)記④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹納斯綠B染液蓋上蓋片染20分鐘。

(二)結(jié)果

油鏡下觀察，顆粒狀的線粒體被詹納斯綠B染成藍(lán)綠色。

標(biāo)簽：細(xì)胞核線粒體分級(jí)分離勻漿器

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