實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)原理與應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ( PCR) 可對(duì)特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增 。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，也可以通過 放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描來進(jìn)行定量的分析 。無論定性還是定量分析，分析的都是 PCR 終產(chǎn)物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經(jīng) PCR 信號(hào)放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量。在這種需求下熒光定量 PCR 技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。所謂的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 就是 通過對(duì) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖 ( 如圖 1) 。

圖 1 實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線圖

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段 , 熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。 PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR 產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）（如圖 2 所示）。

圖 2. 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

CT 值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的 CT 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多， CT 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表 Ct 值（如圖 3 所示）。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

 

圖 3 閾值線和 CT 值

熒光探針和熒光染料

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加。前者由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但后者則簡(jiǎn)便易行。

1．SYBR Green I

圖 4 SYBR GREEN I 工作原理

SYBR Green I 是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈 DNA 結(jié)合染料。與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波長(zhǎng)約為 497nm ，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為 520nm 。 在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR 熒光染料， SYBR 熒光染料特異性地?fù)饺?DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加完全同步。

圖 4. SYBR GREEN I 工作原理

SYBR Green I 在核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)方面有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌�而特別定制，因此設(shè)計(jì)的程序通用性好，且價(jià)格相對(duì)較低。利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA 熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過熔點(diǎn)曲線分析可以識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以、區(qū)分非特異擴(kuò)增，進(jìn)一步地還可以實(shí)現(xiàn)單色多重測(cè)定。此外，由于一個(gè) PCR 產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，因此 SYBR Green I 的靈敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會(huì)影響定量的精確性。通過測(cè)量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響 1 。由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量結(jié)果。

2．分子信標(biāo)（molecular beacon）

分子信標(biāo)是一種在靶 DNA 不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。在此結(jié)構(gòu)中，熒光基團(tuán)被激發(fā)后不是產(chǎn)生光子，而是將能量傳遞給淬滅劑，這一過程稱為熒光諧振能量傳遞（ FRET ）。由于 " 黑色 " 淬滅劑的存在，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。如果第二個(gè)熒光基團(tuán)是淬滅劑，其釋放能量的波長(zhǎng)與熒光基團(tuán)的性質(zhì)有關(guān)。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為 15-30 個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般 5-7 個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標(biāo)必須非常仔細(xì)的設(shè)計(jì)，以致于在復(fù)性溫度下，模板不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，模板存在時(shí)則與模板配對(duì)。與模板配對(duì)后，分子信標(biāo)的構(gòu)象改變使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，它發(fā)出自身波長(zhǎng)的光子（圖 5 ）。

圖 5. 分子信標(biāo)工作原理

3．TaqMan 探針

TaqMan 探針是多人擁有的專利技術(shù)。 TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)。熒光基團(tuán)連接在探針的 5’ 末端，而淬滅劑則在 3’ 末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與 3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的 5’ 外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。 TaqMan 探針適合于各種耐熱的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。

圖 6. Taqman 探針工作原理

4. LUX Primers

LUX (light upon extention) 引物是利用熒光標(biāo)記的引物實(shí)現(xiàn)定量的一項(xiàng)新技術(shù)。目標(biāo)特異的引物對(duì)中的一個(gè)引物 3’ 端用熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對(duì)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在沒有目標(biāo)片斷的時(shí)候，引物與模板配對(duì)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生特異的熒光信號(hào)（如圖 7 ）。

圖 7.LUX 引物工作原理

與 Taqman 探針和分子信標(biāo)相比， LUX 引物通過二級(jí)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)淬滅，不需要熒光淬滅基團(tuán)，也不需要設(shè)計(jì)特異的探針序列。因?yàn)?LUX 引物是一個(gè)相對(duì)較新的技術(shù)，所以其應(yīng)用還有待實(shí)踐的檢驗(yàn)。

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)是 DNA 定量技術(shù)的一次飛躍。運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，我們可以對(duì) DNA 、 RNA 樣品進(jìn)行定量和定性分析。定量分析包括絕對(duì)定量分析和相對(duì)定量分析。前者可以得到某個(gè)樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對(duì)不同方式處理的兩個(gè)樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。除此之外我們還可以對(duì) PCR 產(chǎn)物或樣品進(jìn)行定性分析：例如 利用熔解曲線分析識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，以區(qū)分非特異擴(kuò)增；利用特異性探針進(jìn)行基因型分析及 SNP 檢測(cè)等。 目前 實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。其中最主要的應(yīng)用集中在以下幾個(gè)方面：

1. DNA 或 RNA 的絕對(duì)定量分析 。包括 病原微生物或病毒含量的檢測(cè) , 轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)， RNAi 基因失活率的檢測(cè)等。

2. 基因表達(dá)差異分析。例如比較 經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 ) ，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及 cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證

3. 基因分型。例如 SNP 檢測(cè)，甲基化檢測(cè)等。

隨著實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)的推廣和普及，該技術(shù)必然會(huì)得到更廣泛的應(yīng)用。