一．目的要求
對于一個生物作用過程，其結(jié)果或產(chǎn)物的得到受到多種因素的影響。如發(fā)酵中，菌種的生物活性、酶的濃度、底物濃度、溫度、pH 值、菌種生長環(huán)境中的氧氣、二氧化碳濃度、各種營養(yǎng)成分的比例等。對于這種多因素的實(shí)驗(yàn)，如何合理地設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，提高效率，以達(dá)到所預(yù)期的目的是需要進(jìn)行認(rèn)真考慮和周密準(zhǔn)備的。
本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)法測定酵母用量、葡萄糖濃度、溫度、磷酸鹽用量這四個因素在不同水平對發(fā)酵過程和結(jié)果的影響，并應(yīng)用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)的計(jì)算方法分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，求得什么樣的酵母用量、葡萄糖濃度、溫度、磷酸鹽用量對發(fā)酵效果最好，并確定影響實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素及最適條件。
二．基本原理
正交實(shí)驗(yàn)法是安排多因素、多水平的一種實(shí)驗(yàn)方法，即借助正交表的表格來計(jì)劃安排實(shí)驗(yàn)，并正確地分析結(jié)果，找到實(shí)驗(yàn)的最佳條件，分清因素和水平的主次，這就能通過比較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)達(dá)到好的實(shí)驗(yàn)效果。實(shí)踐證明，正交法是一種行之有效的好方法，被廣泛地運(yùn)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)。 ’
三．正交實(shí)驗(yàn)法的基本步驟
1）．明確試驗(yàn)?zāi)康模�確定評價指標(biāo)
評價指標(biāo)有時只有一個，有時可能有多個。當(dāng)評價指標(biāo)多于兩個，為多指標(biāo)試驗(yàn)。
2）．挑選因素
影響試驗(yàn)指標(biāo)的因素很多，由于試驗(yàn)條件的限制，不可能逐一或全面地加以研究，因此要根據(jù)已有的專業(yè)知識及有關(guān)文獻(xiàn)資料和實(shí)際情況，固定一些因素于最佳水平，排除一些次要的因素，而挑選一些主要因素。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法正是安排多因素試驗(yàn)的有利工具。當(dāng)因素較多時，除非事先根據(jù)專業(yè)知識或經(jīng)驗(yàn)等，能肯定某因素作用很小而不選取外，對于凡是可能起作用或情況不明或看法不一的因素，都應(yīng)當(dāng)選入進(jìn)行考察。
3）．確定各因素的水平
因素的水平分為定性與定量兩種，水平的確定包含兩個含義，即水平個數(shù)的確定和各個水平數(shù)量的確定。 對定性因素，要根據(jù)試驗(yàn)具體內(nèi)容，賦予該因素每個水平以具體含義。定量因素的量大多是連續(xù)變化的，這就要求試驗(yàn)者根據(jù)相關(guān)知識或經(jīng)驗(yàn)、或者文獻(xiàn)資料首先確定該因素的數(shù)量變化范圍，而后根據(jù)試驗(yàn)的目的及性質(zhì)，并結(jié)合正交表的選用來確定因素的水平數(shù)和各水平的取值。每個因素的水平數(shù)可以相等，也可以不等，重要因素或特別希望詳細(xì)了解的因素，其水平可多一些，其他因素的水平可以少一些。如果沒有特別重要的因素需要詳細(xì)考察的話，要盡可能使因素的水平數(shù)相等，以便減小試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理工作量。
4）．制定因素水平表
根據(jù)上面選取的因素及因素的水平的取值，制定一張反映試驗(yàn)所要考察研究的因素及各因素的水平的“因素水平綜合表’’。該表在制定過程中，對于每個因素用哪個水平號碼，對應(yīng)于哪個量可以隨機(jī)地任意確定。一般講最好是打亂次序安排，但一經(jīng)選定之后，試驗(yàn)過程中就不能再變了。
5）．選擇合適的正交表
常用的正交表較多，有幾十個，可以靈活選擇。應(yīng)注意的是，選擇正交表與選擇因素及其水平是相互影響的，必須綜合考慮，而不能將任何一個問題孤立出來。選擇正交表時一般需考慮以下兩個方面的情況：
①所考察因素及其水平的多少。選用的正交表，要能容納所研究的因素?cái)?shù)和因素的水平數(shù)，在這一前提下，應(yīng)選擇試驗(yàn)次數(shù)最小的正交表。
②考慮各因素之間的交互作用。一般說來，兩因素的交互作用通常都有可能存在，而三因素的交互作用在通常情況下可以忽略不計(jì)。
6）．確定試驗(yàn)方案
根據(jù)制定的因素水平表和選定的正交表來安排試驗(yàn)時，一般原則如下：
①如果各因素之間無交互作用，按照因素水平表中固定下來的因素次序，順序地放到正交表的縱列上，每一列放一種因素。
②如果不能排除因素之間的交互作用，則應(yīng)避免將因素的主效應(yīng)安排在正交表的交互效應(yīng)列內(nèi)，以妨礙對因素主效應(yīng)的判斷。
③把各因素的水平按照因素水平表中所確定的關(guān)系，對號入座后，試驗(yàn)方案隨即確定。
7）．正交試驗(yàn)結(jié)果的分析
正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析與正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析相比，具有計(jì)算量小、計(jì)算簡單、分析速度快、一目了然等特點(diǎn)，但分析結(jié)果的精確性與嚴(yán)密性相對于方差分析來說稍差。直觀分析主要可以解決以下兩個問題：
①求最佳水平組合。該問題歸結(jié)為找到各因素分別取何水平時，所得到的試驗(yàn)結(jié)果會最好。 極差的大小直接反映料各個因素對試驗(yàn)指標(biāo)影響的變化幅度，極差大表明該因素的影響越大，是主要因素；反之，極差小，表明該因素的作用不大，屬于次級因素。因此，可以通過比較各個因素的極差大小決定因素的主次順序。但因素影響的顯著性需通過方差分析確定。
四．實(shí)驗(yàn)裝置
圖10－1 為5L 容積的發(fā)酵罐培養(yǎng)裝置示意圖。發(fā)酵罐為不銹鋼制的圓柱形，外有夾套以便加熱或冷卻。攪拌可采用電機(jī)帶動或磁力攪拌器�？諝膺^濾可采用介質(zhì)層過濾或聚乙烯醇PVA 濾芯空氣過濾氣。采用可蒸汽殺菌的pH復(fù)合電極及pH控制裝置，溶解氧分析儀使用的是可反復(fù)蒸汽滅菌、原電極型覆膜電極。
采用2 臺泵，一臺用于流加酸堿，一臺用于流加消泡劑。所使用的輔料管應(yīng)是可蒸汽滅菌，使用的管材有長期耐用的硅膠管(一般用)、氟化橡膠管(碳?xì)浠�合物�?和耐酸、堿用管等。
采用氧分析儀測定尾氣中的氧分壓，用紅外分析儀測定尾氣中二氧化碳分壓。

圖11－1 培養(yǎng)裝置示意圖
五．實(shí)驗(yàn)方法
1) ．菌種：
啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
2）．培養(yǎng)基制備
培養(yǎng)基的加入量一般為罐容積的70％。將稱量好的培養(yǎng)基組分，經(jīng)溶解后加入到發(fā)酵罐中。此時培養(yǎng)液的體積為實(shí)際所需培養(yǎng)基容積的80％。
由于蒸汽殺菌過程中有大量的蒸汽轉(zhuǎn)變?yōu)樗�，使發(fā)酵液體積增大。對于合成培養(yǎng)基的滅菌操作，葡萄糖與磷酸鹽應(yīng)分別滅菌后，在開始培養(yǎng)前加入以避免在殺菌過程中，葡萄糖與氮化合物之間發(fā)生美拉德(Malad)反應(yīng)，以及磷鹽與其他金屬離子形成沉淀。溶液pH5．0.
除排氣口加棉塞，并包牛皮紙或鋁箔外，其他可用橡膠塞或截水夾封住。
3)．安裝控制裝置
連接好各種傳感器的管線及通風(fēng)、水管等,安裝調(diào)試好pH 電極、溫度計(jì)、氧電極、消泡電極等。
4)．殺菌
夾套內(nèi)通入加熱蒸汽，使培養(yǎng)液溫度達(dá)到80℃以上。隨后將蒸汽直接通人發(fā)酵罐，在121℃下殺菌15min。殺菌過程中，間斷打開各閥門，排出內(nèi)部空氣，以保證各出管內(nèi)殺菌完全。殺菌完成后，夾套內(nèi)通入冷卻水，進(jìn)行培養(yǎng)基的冷卻。為保證罐內(nèi)正壓，應(yīng)通入適量無菌空氣。
5)．接菌、培養(yǎng)
檢查溫度、通風(fēng)和pH 等條件正常后接菌，將浸有酒精的脫脂棉圍繞在接種口周圍，點(diǎn)火后打開接種口，加入無菌水，調(diào)節(jié)好罐內(nèi)培養(yǎng)液量,進(jìn)而將種子培養(yǎng)液注入。接種量一般為1%～10％，蓋好接種口后，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速至所需數(shù)值，培養(yǎng)開始。為了解培養(yǎng)過程中的變化，需定時取樣進(jìn)行樣品分析。取樣后應(yīng)通入加熱蒸汽，以防取樣管路污染雜菌。
6)．制定因素水平表和選定正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)
7）．培養(yǎng)結(jié)束
將電極與培養(yǎng)液全部取出，培養(yǎng)液在121℃下殺菌15min 后，排放到指定地點(diǎn)。罐內(nèi)應(yīng)沖洗干凈。
8) 菌體量(X)分析方法
用去離子水適當(dāng)稀釋培養(yǎng)液，在660nm 下測濁度。測干燥重量時，用事先干燥至恒重的定量濾紙(孔徑1．2pm)過濾培養(yǎng)液，用去離子水洗兩次，然后將其干燥至恒重(105℃，10h)，用電子天平稱重。
9) 數(shù)據(jù)處理
畫出培養(yǎng)液中葡萄糖(g／L)、酵母菌體量(g／L)隨培養(yǎng)時間的變化曲線。計(jì)算酵母產(chǎn)率(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，葡萄糖)。

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