1966年，Yamamoto和McIlwain首次在腦片上記錄了電生理活動(dòng)(1966a, b)，證實(shí)了腦組織在體外也能存活，并保持很好的活性狀態(tài)。此后，該方法在生理學(xué)研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，并為中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理和藥理學(xué)領(lǐng)域突飛猛進(jìn)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。1989年，Blanton將腦片電生理記錄與細(xì)胞的膜片鉗記錄結(jié)合起來(lái)，建立了腦片膜片鉗記錄技術(shù)，這為在細(xì)胞水平研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)離子通道或受體在神經(jīng)環(huán)路中的生理和藥理學(xué)作用及其機(jī)制提供了可能性。

在腦片電生理記錄中，實(shí)驗(yàn)者可以按不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹苯訙?zhǔn)確地改變腦片灌流液的成份和條件，如溫度、酸度和滲透壓、通氧狀態(tài)、以及離子通道或細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的阻斷劑等；另外，實(shí)驗(yàn)者還能借助顯微鏡準(zhǔn)確地放置記錄電極和刺激電極，同時(shí)，可借助一些特殊的加藥裝置，將一定濃度的藥物加到整個(gè)腦片或是腦片上的特定區(qū)域上，研究電信號(hào)沿神經(jīng)環(huán)路的傳遞規(guī)律。在電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，活性較好的腦片還可用于生物化學(xué)或解剖學(xué)的分析。這些優(yōu)點(diǎn)使實(shí)驗(yàn)者能獲得準(zhǔn)確的神經(jīng)生理學(xué)的研究結(jié)果，也是其應(yīng)用較在位大腦廣泛的原因所在。

海馬腦片是中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究中應(yīng)用最為廣泛標(biāo)本之一。其原因有以下幾點(diǎn)：1、海馬與腦的其它部位相對(duì)隔離，較易剝離，且剝離后受到的損傷較小；2、海馬具有高度分化的片層結(jié)構(gòu)，一方面，海馬神經(jīng)環(huán)路在片層中的分布有一定的空間規(guī)律，如錐體細(xì)胞胞體分布在錐體細(xì)胞層，而雪氏側(cè)支突觸分布于輻射層，且海馬中存在一個(gè)三突觸聯(lián)系的回路，即穿通纖維-齒狀回顆粒細(xì)胞層、苔狀纖維-CA3區(qū)錐體細(xì)胞層、雪氏側(cè)支-CA1區(qū)錐體細(xì)胞層等，因此，在海馬中可以較準(zhǔn)確地記錄到特定神經(jīng)元或突觸的反應(yīng)；另一方面，這種板層結(jié)構(gòu)有利于解釋在某一部位記錄到的細(xì)胞外場(chǎng)電位的意義。這些都使海馬成為電生理學(xué)研究的理想標(biāo)本。本文對(duì)海馬腦片膜片鉗的操作規(guī)程及注意事項(xiàng)總結(jié)如下。

一、海馬腦片的制備

腦片制備中，海馬分離應(yīng)在斷頭后10分鐘內(nèi)完成，5~6分鐘為宜。在分離海馬時(shí)，還應(yīng)注意不要扭轉(zhuǎn)或撕扯海馬，更不要損傷海馬。分離海馬的速度和質(zhì)量是保證海馬腦片制備成功的關(guān)鍵所在。

評(píng)價(jià)腦片活性最簡(jiǎn)單的方法是記錄腦片上的群峰。在一個(gè)狀態(tài)良好的腦片上記錄到的群峰在一個(gè)很寬的刺激強(qiáng)度范圍內(nèi)始終是單峰的。出現(xiàn)多個(gè)群峰往往提示抑制性突觸功能已受損，這是腦片最早的病理生理學(xué)改變。如果僅存在突觸前纖維群峰(Fiber Volley, FV)，或FV峰大于突觸后反應(yīng)，這提示腦片活性極差，有活性的突觸已所剩無(wú)幾，為激發(fā)突觸反應(yīng)需要更多的突觸前纖維參與，需中止實(shí)驗(yàn)。在活性較好的腦片中，F(xiàn)V峰幾乎探測(cè)不到，或遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于突觸后反應(yīng)。

有時(shí)會(huì)莫名其妙地出現(xiàn)一些問題，突觸標(biāo)本中突觸后神經(jīng)元看上去狀態(tài)良好，但做了很多天甚至幾周都沒有得到有用的數(shù)據(jù)。在這種情況下，須要耐心地思考失敗的原因，并設(shè)法解決。首先，應(yīng)該檢查溶液，用其它實(shí)驗(yàn)室制備的標(biāo)本或更換實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。對(duì)于腦片的制備而言，切片機(jī)出現(xiàn)的機(jī)械故障會(huì)損壞腦片的質(zhì)量�？傊�，在實(shí)驗(yàn)的全過程中能盡量注意每一個(gè)細(xì)節(jié)問題，出現(xiàn)問題后反復(fù)嘗試，實(shí)驗(yàn)就會(huì)容易起來(lái)。

二、海馬腦片的膜片鉗記錄

1、將刺激電極放置在含突觸前纖維腦片區(qū)域附近

在突觸傳遞的研究中，應(yīng)該同時(shí)記錄突觸前和突觸后神經(jīng)元的電信號(hào)，雖然，并不是所有突觸前神經(jīng)元胞體的動(dòng)作電位均可傳導(dǎo)至突觸 (Vincent, 1996)。由于在突觸前和突觸后兩個(gè)神經(jīng)元上同時(shí)做膜片鉗記錄較困難，因此，需要用其它的方法來(lái)誘發(fā)突觸前動(dòng)作電位的發(fā)放。用刺激電極可在單個(gè)或多個(gè)突觸前細(xì)胞或軸突誘發(fā)動(dòng)作電位。另外，還可以用局部施加神經(jīng)遞質(zhì)的方法來(lái)誘導(dǎo)動(dòng)作電位，如用短促的壓力、離子電泳或籠鎖谷氨酸光解等方法將谷氨酸加到突觸前胞體或軸突上，可以誘導(dǎo)出多個(gè)動(dòng)作電位。

用電極刺激 在神經(jīng)元培養(yǎng)皿中，可以用連接了電源(通常是膜片鉗放大器)的微電極直接刺激突觸前神經(jīng)元。在這種情況下，通常需要用負(fù)壓吸引使突觸前的細(xì)胞貼緊刺激電極，防止刺激電流的逸出。通過膜片鉗放大器給脈沖刺激的優(yōu)點(diǎn)是，它可以記錄到突觸前細(xì)胞被激活的胞外電信號(hào)(Role, 1987)。從培養(yǎng)的神經(jīng)元和腦片上找到有突觸聯(lián)系的一對(duì)神經(jīng)元是很困難的，但在神經(jīng)元培養(yǎng)中有單個(gè)神經(jīng)元的Autapic突觸就會(huì)方便許多。

可以用膜片鉗電極或尖端較細(xì)的一對(duì)鎢電極給突觸前軸突纖維施加電壓脈沖。用電極刺激可將Ag/AgCl電極置于孵育槽中與其構(gòu)成一電流回路。刺激電流一定要與膜片鉗放大器記錄電路隔離開，以防止刺激電流漏入記錄電極中，而使刺激尾跡變得很大。為此，施加刺激需要一個(gè)未接地的隔離器。隔離器可以用外界脈沖刺激或計(jì)算機(jī)來(lái)控制。另外，還需要將刺激尾跡縮小到最小，以排除其對(duì)突觸信號(hào)起始段的干擾。為達(dá)到該目的，需將刺激電路的回路電極置于合適的位置或用膜片鉗放大器提高串聯(lián)電阻補(bǔ)償?shù)男�率�?br>
刺激電極的位置 通常將刺激微電極或刺激電極置于突觸前軸突通過的部位。但有時(shí)突觸前軸突在制備腦片時(shí)即被去除。如果腦片制備時(shí)局部神經(jīng)環(huán)路被破壞，實(shí)驗(yàn)中就很難成功地記錄到突觸后電流。實(shí)際上，切腦片的角度是保存局部神經(jīng)環(huán)路最重要的因素之一，合適的角度既可使突觸后神經(jīng)元保存完好，也可保留部分較長(zhǎng)的突觸前纖維用于電刺激。用胞外電極刺激激活的神經(jīng)纖維較多，而且，每次刺激激活的纖維數(shù)目也會(huì)不同。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍⒉煌�的傳�?dǎo)通路分開，那么，必須要證明兩個(gè)刺激電極激活的纖維各不相同。

2、全細(xì)胞記錄

用可視化膜片鉗尋找清楚、且表面光滑、折光性較好的突觸后神經(jīng)元。在加了正壓后，將記錄電極移入腦片視野中，并接近事先選好的神經(jīng)元，然后，調(diào)整電極與神經(jīng)元的相對(duì)位置，利用負(fù)壓形成穩(wěn)定的高阻封接。用短簇的脈沖負(fù)壓使細(xì)胞破膜，穩(wěn)定2~3分鐘，觀察封接測(cè)試波形起始段與基線間的差值是否在100pA以內(nèi)，封接電阻是否大于200M，如果是，且較穩(wěn)定，再迅速補(bǔ)償串聯(lián)電阻和慢電容，舍棄串聯(lián)電阻大于30M的細(xì)胞，且在記錄過程中監(jiān)測(cè)串聯(lián)電阻的變化，當(dāng)變化大于20%時(shí)，中止記錄。如果細(xì)胞狀態(tài)不好，就馬上重新制備腦片，以提高實(shí)驗(yàn)效率。

3、判斷突觸前纖維

在記錄電刺激的突觸反應(yīng)時(shí)，可以驗(yàn)證刺激電極是否放置在突觸前神經(jīng)元或軸突上，在實(shí)驗(yàn)中，如果記錄不到突觸反應(yīng)，說(shuō)明刺激電極位置不正確，這時(shí)可以稍微移動(dòng)刺激電極的位置。如果還記錄不到，這可能還與組織片活性較差有關(guān)，可以更換組織片或改進(jìn)切片角度加以解決。電刺激方波時(shí)程一般設(shè)定為0.1~0.2ms，恒流條件下刺激強(qiáng)度一般為0.1~3mA，恒壓條件下刺激強(qiáng)度為5~40V.

4、突觸反應(yīng)的判斷及其波幅穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)

突觸信號(hào)的判斷 突觸信號(hào)樣的假象波有三個(gè)來(lái)源。第一、鄰近纖維的活動(dòng)使靜止細(xì)胞產(chǎn)生電壓波動(dòng)；第二、如果恒流刺激強(qiáng)度過大，電流就可被注入突觸后神經(jīng)元，使其產(chǎn)生失活時(shí)間類似EPSP或EPSC的信號(hào)，其信號(hào)幅度隨刺激強(qiáng)度的變化而變化；第三、直接刺激突觸后神經(jīng)元誘導(dǎo)出突觸樣的動(dòng)作電位，這種反應(yīng)緊接著刺激尾跡發(fā)生，沒有翻轉(zhuǎn)電位，使突觸后神經(jīng)元膜電位超極化和向記錄電極內(nèi)液中加入10mM的QX-314，均可避免突觸后神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位。但QX-314可阻斷多種突觸激活的通道(Otis, 1993)，在某些情況下它還可以增加漏電流。

多突觸激活 通常情況下，刺激電流可激活多個(gè)突觸前纖維，在突觸后可記錄到多種突觸信號(hào)。因此，有必要用一些選擇性阻斷劑阻斷一些不在研究范圍內(nèi)的突觸活動(dòng)。而且，刺激一束纖維，通常可激活多個(gè)同種的突觸前纖維。不同的刺激強(qiáng)度下，被激活的突觸前纖維數(shù)目不同，從而引起的突觸反應(yīng)也會(huì)不同。因此，要仔細(xì)調(diào)節(jié)刺激部位和刺激強(qiáng)度以便能刺激到單一的軸突(Stevens, 1995; Zhang, 1994a)。胞內(nèi)刺激突觸前細(xì)胞是刺激單個(gè)軸突最好且最穩(wěn)定的方法。

甚至在單個(gè)突觸前神經(jīng)元被激活后，在突觸后記錄到的反應(yīng)也是由多種神經(jīng)遞質(zhì)共同作用的結(jié)果。多突觸活動(dòng)是突觸活動(dòng)的疊加效應(yīng)，這包括去極化和超級(jí)化反應(yīng)。在一些標(biāo)本中，這是不可避免的。通�？捎盟幬镒钄嗖辉谘芯糠秶鷥�(nèi)的突觸活動(dòng)。提高灌流液中鈣鎂等二價(jià)陽(yáng)離子的濃度至5mM，以增加動(dòng)作電位的閾值，就可以有效地減少多突觸活動(dòng)。通常情況下，突觸反應(yīng)是否來(lái)自單突觸可以根據(jù)如下條件來(lái)判斷：潛伏時(shí)在0.5~1.5ms的范圍內(nèi)，高頻刺激時(shí)突觸反應(yīng)立即消失，突觸反應(yīng)的上升支和下降支較平滑，且無(wú)長(zhǎng)潛伏時(shí)成份(Berry, 1976)。

電刺激引起的突觸反應(yīng)波幅在一定范圍內(nèi)的波動(dòng)是一種正�，F(xiàn)象，但記錄過程中有電流衰減發(fā)生，當(dāng)記錄過程中電流衰減大于10~15%，就必須中止實(shí)驗(yàn)。如果電流衰減不可避免，就需記錄較長(zhǎng)時(shí)間確定電流衰減的速度。低頻刺激(0.1~1Hz)下，記錄幾分鐘，觀察突觸反應(yīng)波幅的相對(duì)穩(wěn)定性。

電極內(nèi)液成份與受體敏感性 在形成全細(xì)胞記錄后，胞內(nèi)成份會(huì)被電極內(nèi)液成份所稀釋而發(fā)生改變，但在10分鐘內(nèi)即可達(dá)到平衡。因此，要記錄G蛋白耦聯(lián)受體的活性時(shí)，應(yīng)向電極內(nèi)液中加入10~100uM 的GTP(Trussell, 1987)。離子通道耦聯(lián)的NMDA和GABAA受體的特性在全細(xì)胞記錄過程中也會(huì)隨時(shí)間的變化而衰減。在記錄時(shí)可用多種方法來(lái)避免或減小其衰減，如提高電極內(nèi)液EGTA的濃度或用BAPTA等快速絡(luò)合劑代替EGTA，使胞內(nèi)鈣濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1μM；向電極內(nèi)液中加入mM級(jí)的ATP；采用穿孔膜片鉗記錄等。另外，電極的串聯(lián)電阻小于10MΩ或突觸距胞體較近時(shí)受體的敏感性會(huì)很快下降。

電壓鉗制是否準(zhǔn)確 在電壓鉗制不足的情況下，記錄突觸后電流，雖然，可以為突觸藥理學(xué)和突觸效能的活動(dòng)依賴性的改變提供很有用的信息，但這些數(shù)據(jù)不能用于突觸后電流幅度和時(shí)程的準(zhǔn)確估計(jì)。那么，我們?nèi)绾闻袛嗝看斡涗洉r(shí)電壓鉗制的質(zhì)量呢？如果突觸后電流來(lái)自樹突遠(yuǎn)端，那么，該突觸后電流的鉗制質(zhì)量就較低(Silver, 1996)。另外，還有一些判斷鉗制質(zhì)量的方法，如突觸電流的上升時(shí)間較長(zhǎng)(如AMPA受體電流的上升時(shí)間大于1ms)；在某一突觸后電流的翻轉(zhuǎn)電位下可見到雙相的突觸后電流等。

評(píng)價(jià)電壓鉗制質(zhì)量最常用的方法就是在一次記錄后，繪制上升時(shí)間對(duì)下降時(shí)間曲線圖。如果上升和下降時(shí)間被樹突過濾過，則該曲線呈正相關(guān)關(guān)系，上升或下降時(shí)間與幅度間就會(huì)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系�？傊�，上升時(shí)間受樹突過濾的影響要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于下降時(shí)間。因此，如果隨上升時(shí)間的變化，下降時(shí)間變化較小，這種情況下的下降時(shí)間是可靠的(Hestrin, 1990)。需要注意的是，上升時(shí)間與下降時(shí)間相關(guān)性較差并不足以判斷電壓鉗制的質(zhì)量。Johnston等對(duì)樹突上突觸反應(yīng)的鉗制效果做了深入的討論(Brown and Johnston, 1983; Spruston, 1993)。Husser (1997)等建議用突觸電導(dǎo)隨鉗制電位的變化來(lái)檢測(cè)樹突突觸反應(yīng)的幅度和動(dòng)力學(xué)特性。

在突觸后電流較大時(shí)也存在鉗制的偏差。這時(shí)，由電極串聯(lián)電阻引起的電壓降會(huì)影響到突觸后電流的幅度和形狀。若想驗(yàn)證是否存在這個(gè)問題，可以向灌流液中加入少許受體的高親和力的阻斷劑，觀察突觸后電流的時(shí)程是否會(huì)隨其峰值的下降而變化，因?yàn)椋�受體的阻斷不會(huì)改變其動(dòng)力學(xué)特性(Otis, 1996; Zhang, 1994b)；另外，可以改變串聯(lián)電阻補(bǔ)償?shù)乃�平，觀察在不同的補(bǔ)償水平下突觸后電流會(huì)不會(huì)改變(Llano, 1991; Takahashi, 1995)。在許多情況下，有可能在發(fā)現(xiàn)偏差后更正突觸后電流的下降時(shí)間。值得注意的是，串聯(lián)電阻可以帶來(lái)其它的偏差，如對(duì)波形的濾波效應(yīng)。盲法膜片鉗記錄中，串聯(lián)電阻通常要大于10MΩ，因此，這種影響是不可避免的。但可以用公式1/(2pRseriesCM)計(jì)算記錄系統(tǒng)的過濾水平，確定突觸后電流峰值和形狀受影響的程度。

5、突觸反應(yīng)的記錄

現(xiàn)在許多實(shí)驗(yàn)室都開始應(yīng)用膜片鉗技術(shù)記錄培養(yǎng)神經(jīng)元間、組織片中和異體移植組織中的突觸傳遞。與尖電極記錄相比，它具有明顯的優(yōu)勢(shì)。如，記錄的成功率較高，較高的信噪比，能較準(zhǔn)確地鉗制胞電位等。膜片鉗甚至可以應(yīng)用于在位突觸活動(dòng)的記錄(Covey, 1996)。

記錄自發(fā)突觸后反應(yīng) 自發(fā)的突觸后反應(yīng)有兩個(gè)來(lái)源。一是局部神經(jīng)環(huán)路中動(dòng)作電位發(fā)放引起的遞質(zhì)釋放，另一個(gè)是突觸囊泡中遞質(zhì)的自發(fā)釋放，后者被稱為微突觸反應(yīng)(miniature synaptic event)。由于動(dòng)作電位依賴性的自發(fā)突觸反應(yīng)幅度與微突觸反應(yīng)差別并不大，因此沒有必要將兩者區(qū)分開來(lái)。為記錄到很純的微突觸反應(yīng)，可以用TTX來(lái)阻斷動(dòng)作電位依賴性自發(fā)突觸反應(yīng)，另外，去除灌流液中的鈣或向其中加入鈣通道阻斷劑鎘，即可以阻斷電刺激誘發(fā)的遞質(zhì)釋放。但如果多個(gè)囊泡在同一個(gè)突觸末梢中同步釋放，則以上兩種方法的效果就不同了(Korn, 1994)。

自發(fā)性突觸活動(dòng)的發(fā)放頻率通常小于幾Hz。發(fā)育期標(biāo)本上，自發(fā)性突觸活動(dòng)的頻率就非常低(Edwards, 1990)，因此，需要記錄較長(zhǎng)時(shí)間才能獲得足夠用于分析的突觸反應(yīng)。如果自發(fā)性突觸反應(yīng)的頻率很高，多個(gè)突觸的反應(yīng)就會(huì)重疊在一起，就不能通過上升或下降支的時(shí)間來(lái)判斷是單個(gè)突觸反應(yīng)或是多個(gè)突觸反應(yīng)的疊加，從而，給數(shù)據(jù)分析帶來(lái)許多麻煩。突觸反應(yīng)的頻率受溫度的影響較大(Fatt, 1952)，因此，在特定的實(shí)驗(yàn)中，可以通過調(diào)節(jié)灌流液的溫度來(lái)調(diào)整合適的突觸反應(yīng)頻率。局部施加去極化或超極化溶液也可以誘發(fā)自發(fā)突觸活動(dòng)(Bekkers, 1992; Tang, 1994)。在一些標(biāo)本中，在刺激誘發(fā)的突觸反應(yīng)之后，自發(fā)性突觸反應(yīng)的頻率會(huì)顯著增高，在含有鍶的灌流液中尤其如此(Dodge, 1969; Goda, 1994)。這一事實(shí)可用于檢測(cè)與特定突觸活動(dòng)相關(guān)的量子大小(Otis, 1996)。

數(shù)據(jù)采集 突觸反應(yīng)可用計(jì)算機(jī)軟件通過特定的采集卡采集到計(jì)算機(jī)硬盤上。記錄電刺激的突觸活動(dòng)時(shí)，還須用計(jì)算機(jī)產(chǎn)生一個(gè)TTL脈沖以激活刺激器，并由隔離器經(jīng)刺激電極刺激突觸前纖維。

所需的數(shù)據(jù)量 電刺激所誘導(dǎo)的突觸信號(hào)的記錄中，其數(shù)據(jù)量取決于信噪比和信號(hào)的變異度。對(duì)電刺激誘導(dǎo)的全細(xì)胞電流記錄而言，高信噪比不是問題，但在記錄自發(fā)突觸信號(hào)時(shí)，信噪比就變得比較重要了。實(shí)驗(yàn)前最好做預(yù)實(shí)驗(yàn)，估計(jì)獲得準(zhǔn)確的均數(shù)所需記錄的信號(hào)數(shù)。當(dāng)然，也應(yīng)了解給定的刺激頻率下突觸信號(hào)的穩(wěn)定性。對(duì)于電刺激誘導(dǎo)的突觸信號(hào)，其峰值的變異系數(shù)較小，因此，以0.1Hz的刺激頻率記錄5~10次就足夠了。對(duì)于自發(fā)性突觸信號(hào)來(lái)說(shuō)，信號(hào)峰值的變異度較大，通常大于20%，為得到較可靠的結(jié)果往往需要記錄100個(gè)以上的信號(hào)。實(shí)際上，要得出準(zhǔn)確的變異，往往需要記錄成百上千次信號(hào)，這也是得到較可靠的信號(hào)峰值分布規(guī)律的必要條件。在低頻刺激下記錄突觸信號(hào)時(shí)，要控制系統(tǒng)誤差，使記錄保持穩(wěn)定，須要制備活性較好的標(biāo)本，并要有配套的穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)條件。精確的測(cè)量控制是保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性的基礎(chǔ)，而且，每次實(shí)驗(yàn)都要對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的評(píng)價(jià)。

6、突觸反應(yīng)的分析

(1) 刺激誘發(fā)的突觸反應(yīng)的分析

突觸反應(yīng)的大小和形狀 突觸電流和電位的檢測(cè)指標(biāo)有潛伏時(shí)(latency)、峰值(amplitude)、10~90%上升時(shí)間(10~90% rise time)、1/2峰值時(shí)的波寬(half width)、失活的指數(shù)擬合時(shí)間常數(shù)(exponential decay curve)(圖1)。潛伏時(shí)是刺激尾跡(stimulus artifact)的起始時(shí)間到突觸電流或電位峰值的5%間的時(shí)間間隔(Zhang, 1994a)，潛伏時(shí)包括幾部分的延遲：突觸前軸突發(fā)放和傳播動(dòng)作電位的時(shí)間、神經(jīng)末梢去極化到遞質(zhì)釋放的突觸延遲、遞質(zhì)擴(kuò)散到突觸后并引起受體激活的時(shí)間。由于遞質(zhì)擴(kuò)散和受體激活的速度相當(dāng)快，因此，突觸延遲是突觸前神經(jīng)末梢發(fā)放動(dòng)作電位和出現(xiàn)突觸后反應(yīng)間的時(shí)間間隔(Isaacson, 1995; Katz, 1965; Zhang, 1994a)。

突觸反應(yīng)的幅度是其峰值與反應(yīng)前基線間的差值。信噪比較低時(shí)，須要計(jì)算突觸反應(yīng)前多個(gè)點(diǎn)和突觸反應(yīng)峰值前后多個(gè)點(diǎn)的均值，然后，以它們間的差值作為突觸反應(yīng)的幅度。上升時(shí)間用從峰值的10%到90%的時(shí)間描述較為準(zhǔn)確。由于潛伏時(shí)的存在，很難判斷突觸反應(yīng)開始的時(shí)間和到達(dá)峰值的時(shí)間。當(dāng)刺激尾跡嚴(yán)重地干擾了突觸反應(yīng)起始的判斷時(shí)，也可以用20~80%上升段的時(shí)間來(lái)描述上升時(shí)間。突觸反應(yīng)時(shí)程可以用以下幾種方法來(lái)描述：1、1/2峰值間的時(shí)間，它包括了上升時(shí)間和下降時(shí)間；2、突觸反應(yīng)的下降支經(jīng)多種指數(shù)擬合(如單指數(shù)擬合、雙指數(shù)擬合和多指數(shù)擬合)產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)時(shí)間常數(shù)(decay time constant)。

雙脈沖易化(paired pulse facilitation, PPF)，即以較短的間隔重復(fù)刺激突觸前纖維兩次，第二次刺激誘發(fā)的突觸反應(yīng)大于第一次刺激的現(xiàn)象，這是一種突觸前現(xiàn)象，它可反映突觸前遞質(zhì)釋放概率的變化。

最小刺激誘發(fā)的突觸反應(yīng) 記錄最小刺激(僅能激活一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)突觸前纖維的刺激)誘發(fā)的突觸反應(yīng)可用于估計(jì)量子的大小，這種刺激有時(shí)可以誘發(fā)突觸反應(yīng)(success)，而有時(shí)則不能(failure)，其誘導(dǎo)出的突觸反應(yīng)的均值可用于估計(jì)單個(gè)量子的大小。

可分析電刺激誘發(fā)的突觸反應(yīng)的軟件 有許多常規(guī)軟件均可用于突觸反應(yīng)的分析，如Axon公司開發(fā)的pClAMP軟件包，WaveMetrics公司開發(fā)的Igor Pro等，均可用于電刺激誘發(fā)的突觸反應(yīng)的分析。

(2) 自發(fā)性突觸反應(yīng)的分析

突觸反應(yīng)的檢測(cè) 目前有三種方法判斷自發(fā)性突觸反應(yīng)(Hwang，1999)。第一、峰值超過即定閾值，該方法受基線波動(dòng)的影響較大，這可以通過基線加以彌補(bǔ)；第二、峰值相對(duì)于基線的變化量超過閾值，它受高頻噪聲的干擾較大，而且，很難設(shè)定一個(gè)合適的閾值，為克服這些不足，可以在處理時(shí)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行濾波處理，除去高頻噪聲；第三、與即定的波形模板進(jìn)行比較，然后，判斷是否突觸反應(yīng)，該方法對(duì)符合模板的突觸反應(yīng)具有很高的敏感性，但在設(shè)定模板前，必須知道所要研究的突觸反應(yīng)的一系列參數(shù)的范圍，如果模板設(shè)計(jì)不合理，將大大降低探測(cè)的敏感性，而且這種方式尤其不適于有信號(hào)重疊或多個(gè)突觸成份數(shù)據(jù)的分析。

PCLAMP 9.0對(duì)自發(fā)突觸反應(yīng)的分析基于波形模板，只要模板設(shè)計(jì)得當(dāng)，探測(cè)概率也較高。另外，Copenhagen等用Igor Pro開發(fā)了一個(gè)分析程序minifit.ipf。該程序?qū)Φ诙�種方法做了一些改進(jìn)，分三步探測(cè)突觸反應(yīng)。第一步，粗篩可能的突觸反應(yīng)，包括它們的起始時(shí)間和峰值時(shí)間；第二步，用突觸反應(yīng)起始與峰值間的差值計(jì)算可能的突觸反應(yīng)的波幅，去除波幅小于閾值的波形；第三步，對(duì)起始點(diǎn)之前數(shù)點(diǎn)和峰值時(shí)間后的多個(gè)點(diǎn)取平均值，以排除噪聲的影響，并計(jì)算兩者間的差值對(duì)突觸反應(yīng)的峰值做更精確的估計(jì)，如果該波幅低于閾值，與會(huì)從數(shù)據(jù)庫(kù)中被刪除。除波幅閾值的判斷標(biāo)準(zhǔn)外，該程序還還引入了上升時(shí)間、下降時(shí)間和波形時(shí)程范圍等描述波形模板的參數(shù)來(lái)進(jìn)一步判斷突觸反應(yīng)。該程序還可用于測(cè)量突觸反應(yīng)的生物物理學(xué)特征。它可計(jì)算10~90%上升時(shí)間，描述突觸反應(yīng)的上升相的動(dòng)力學(xué)。該程序調(diào)用了Levenberg-Marquardt非線性曲線擬合函數(shù)對(duì)突觸反應(yīng)的下降相做單指數(shù)或雙指數(shù)擬合，通過雙指數(shù)擬合與單指數(shù)擬合的比較檢驗(yàn)，計(jì)算其失活時(shí)間常數(shù)。該程序還提供了一個(gè)非常有用的功能，就是將所有記錄到的非連續(xù)的突觸反應(yīng)以上升支的中點(diǎn)為基礎(chǔ)相疊加，做逐點(diǎn)平均，這樣，既可以降低噪聲，也可以計(jì)算其動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)。

總之，腦片膜片鉗記錄成功的前提是制備活性較好的腦片，記錄條件優(yōu)化后，實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性、可重復(fù)性和準(zhǔn)確性均較高，在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛。許多神經(jīng)毒物可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸傳遞功能，腦片膜片鉗技術(shù)將為實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、高效地研究這些毒物作用的機(jī)制提供可靠的技術(shù)支持。