層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），它是在1903-1906年由俄國(guó)植物學(xué)家M. Tswett首先系統(tǒng)提出來(lái)的。他將葉綠素的石油醚溶液通過(guò)CaCO3管柱，并繼續(xù)以石油醚淋洗，由于CaCO3對(duì)葉綠素中各種色素的吸附能力不同，色素被逐漸分離，在管柱中出現(xiàn)了不同顏色的譜帶或稱色譜圖（Chromatogram）。

當(dāng)時(shí)這種方法并沒引起人們的足夠注意，直到1931年將該方法應(yīng)用到分離復(fù)雜的有機(jī)混合物，人們才發(fā)現(xiàn)了它的廣泛用途。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及生產(chǎn)實(shí)踐的需要，層析技術(shù)也得到了迅速的發(fā)展。為此作出重要貢獻(xiàn)的當(dāng)推英國(guó)生物學(xué)家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論。這是在色譜柱操作參數(shù)基礎(chǔ)上模擬蒸餾理論，以理論塔板來(lái)表示分離效率，定量的描述、評(píng)價(jià)層析分離過(guò)程。其次，他們根據(jù)液－液逆流萃取的原理，發(fā)明了液－液分配色譜。特別是他們提出了遠(yuǎn)見卓識(shí)的預(yù)言：一、流動(dòng)相可用氣體代替液體，與液體相比，物質(zhì)間的作用力減小了，這對(duì)分離更有好處；二、使用非常細(xì)的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應(yīng)能得到最小的理論塔板高(即增加了理論塔板數(shù))，這將會(huì)大大提高分離效率。前者預(yù)見了氣相色譜的產(chǎn)生，并在1952年誕生了氣相色譜儀，它給揮發(fā)性的化合物的分離測(cè)定帶來(lái)了劃時(shí)代的變革；后者預(yù)見了高效液相色譜（HPLC）的產(chǎn)生，在60年代末也為人們所實(shí)現(xiàn)，現(xiàn)在HPLC已成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域不可缺少的分析分離工具之一。因此, Martin和Synge于1952年被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。如今的色層分析法經(jīng)常用于分離無(wú)色的物質(zhì)，已沒有顏色這個(gè)特殊的含義。但色譜法或色層分析法這個(gè)名字仍保留下來(lái)沿用�，F(xiàn)在我們簡(jiǎn)稱為層析法或?qū)游黾夹g(shù)。
層析法的最大特點(diǎn)是分離效率高，它能分離各種性質(zhì)極相類似的物質(zhì)。而且它既可以用于少量物質(zhì)的分析鑒定，又可用于大量物質(zhì)的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究與工業(yè)生產(chǎn)上�，F(xiàn)在，它在石油、化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域都發(fā)揮著十分重要的作用。


層析的基本理論
層析法是一種基于被分離物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的不同，使它們?cè)谀撤N基質(zhì)中移動(dòng)速度不同而進(jìn)行分離和分析的方法。例如：我們利用物質(zhì)在溶解度、吸附能力、立體化學(xué)特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學(xué)反應(yīng)等方面的差異，使其在流動(dòng)相與固定相之間的分配系數(shù)（或稱分配常數(shù)）不同，達(dá)到彼此分離的目的。
對(duì)于一個(gè)層析柱來(lái)說(shuō)，可作如下基本假設(shè)：
1. 層析柱的內(nèi)徑和柱內(nèi)的填料是均勻的，而且層析柱由若干層組成。每層高度為H，稱為一個(gè)理論塔板。塔板一部分為固定相占據(jù)，一部分為流動(dòng)相占據(jù)，且各塔板的流動(dòng)相體積相等，稱為板體積，以Vm表示。
2. 每個(gè)塔板內(nèi)溶質(zhì)分子在固定相與流動(dòng)相之間瞬間達(dá)到平衡，且忽略分子縱向擴(kuò)散。
3. 溶質(zhì)在各塔板上的分配系數(shù)是一常數(shù)，與溶質(zhì)在塔板的量無(wú)關(guān)。
4. 流動(dòng)相通過(guò)層析柱可以看成是脈沖式的間歇過(guò)程（即不連續(xù)過(guò)程）。從一個(gè)塔板到另一個(gè)塔板流動(dòng)相體積為Vm。當(dāng)流過(guò)層析柱的流動(dòng)相的體積為V時(shí)，則流動(dòng)相在每個(gè)塔板上跳越的次數(shù)為n:n =
5. 溶質(zhì)開始加在層析柱的第零塔板上。根據(jù)以上假定，將連續(xù)的層析過(guò)程分解成了間歇的動(dòng)作，這與多次萃取過(guò)程相似，一個(gè)理論塔板相當(dāng)于一個(gè)兩相平衡的小單元。


層析的基本概念
1. 固定相：
固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對(duì)層析的效果起著關(guān)鍵的作用。
2. 流動(dòng)相：
在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之一。
3. 分配系數(shù)及遷移率（或比移值）：
分配系數(shù)是指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動(dòng)相中含量（濃度）的比值，常用K來(lái)表示。分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)。
K=Cs/Cm
其中Cs: 固定相中的濃度，Cm: 流動(dòng)相中的濃度。
遷移率（或比移值）是指：在一定條件下，在相同的時(shí)間內(nèi)某一組分在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相本身移動(dòng)的距離之比值。常用Rf來(lái)表示。（Rf大于或等于1）可以看出：K增加，Rf減少；反之，會(huì)減少，Rf增加。
實(shí)驗(yàn)中我們還常用相對(duì)遷移率的概念。相對(duì)遷移率是指：在一定條件下，在相同時(shí)間內(nèi)，某一組分在固定相中移動(dòng)的距離與某一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在固定相中移動(dòng)的距離之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx來(lái)表示。不同物質(zhì)的分配系數(shù)或遷移率是不同的。分配系數(shù)或遷移率的差異程度是決定幾種物質(zhì)采用層析方法能否分離的先決條件。很顯然，差異越大，分離效果越理想。
分配系數(shù)主要與下列因素有關(guān)：①被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)；②固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)；③層析柱的溫度。對(duì)于溫度的影響有下列關(guān)系式：
lnK = －(DG0/RT)
式中： K為分配系數(shù)（或平衡常數(shù)）
DG0為標(biāo)準(zhǔn)自由能變化
R為氣體常數(shù)
T為絕對(duì)溫度
這是層析分離的熱力學(xué)基礎(chǔ)。一般情況下，層析時(shí)組分的DG0為負(fù)值，則溫度與分配系數(shù)成反比關(guān)系。通常溫度上升20°C, K值下降一半，它將導(dǎo)致組分移動(dòng)速率增加。這也是為什么在層析時(shí)最好采用恒溫柱的原因。有時(shí)對(duì)于K值相近的不同物質(zhì)，可通過(guò)改變溫度的方法，增大K值之間的差異，達(dá)到分離的目的。
4. 分辨率（或分離度）
分辨率一般定義為：相鄰兩個(gè)峰的分開程度。用Rs來(lái)表示。圖3－2 是計(jì)算分辨率的示意圖。


分辨率：
由上式可見，Rs值越大，兩種組分分離的越好。當(dāng)Rs = 1時(shí)，兩組分具有教好的分離，互相沾染約2%，即每種組分的純度約為98%。當(dāng)Rs=1.5時(shí)，兩組分基本完全分開，每種組分的純度可達(dá)到99.8%。如果兩種組分的濃度相差較大時(shí)，尤其要求較高的分辨率。
為了提高分辨率Rs 的值，可采用以下方法：
⑴ 使理論塔板數(shù)N增大，則Rs上升。
① 增加柱長(zhǎng)，N可增大，可提高分離度，但它造成分離的時(shí)間加長(zhǎng)，洗脫液體積增大，并使洗脫峰加寬，因此不是一種特別好的辦法。
② 減小理論塔板的高度。如減小固定相顆粒的尺寸，并加大流動(dòng)相的壓力。高效液相色譜(HPLC)就是這一理論的實(shí)際應(yīng)用。一般液相層析的固定相顆粒為100mm；而HPLC柱子的固定相顆粒為10mm以下，且壓力可達(dá)150kg/cm。它使Rs大大提高，也使分離的效率大大提高了。
③ 采用適當(dāng)?shù)牧魉�，也可使理論塔板的高度降低，增大理論塔板�?shù)。太高或太低的流速都是不可取的。對(duì)于一個(gè)層析柱，它有一個(gè)最佳的流速。特別是對(duì)于氣相色譜，流速影響相當(dāng)大。
⑵ 改變?nèi)萘恳蜃覦（固定相與流動(dòng)相中溶質(zhì)量的分布比）。一般是加大D，但D的數(shù)值通常不超過(guò)10，再大對(duì)提高Rs不明顯，反而使洗脫的時(shí)間延長(zhǎng)，譜帶加寬。一般D限制在1 ￡ D ￡ 10，最佳范圍在1.5-5之間。我們可以通過(guò)改變柱溫（一般降低溫度），改變流動(dòng)相的性質(zhì)及組成（如改變pH值，離子強(qiáng)度，鹽濃度，有機(jī)溶劑比例等），或改變固定相體積與流動(dòng)相體積之比（如用細(xì)顆粒固定相，填充的緊密與均勻些），提高D值，使分離度增大。
⑶ 增大a（分離因子，也稱選擇性因子，是兩組分容量因子D之比），使Rs變大。實(shí)際上，使 a 增大，就是使兩種組分的分配系數(shù)差值增大。同樣，我們可以通過(guò)改變固定相的性質(zhì)、組成，改變流動(dòng)相的性質(zhì)、組成，或者改變層析的溫度，使 a 發(fā)生改變。應(yīng)當(dāng)指出的是，溫度對(duì)分辨率的影響，是對(duì)分離因子與理論塔板高度的綜合效應(yīng)。因?yàn)闇囟壬�高，理論塔板高度有時(shí)會(huì)降低，有時(shí)會(huì)升高，這要根據(jù)實(shí)際情況去選擇。通常，a 的變化對(duì)Rs影響最明顯。
總之，影響分離度或者說(shuō)分離效率的因素是多方面的。我們應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)際情況綜合考慮，特別是對(duì)于生物大分子，我們還必須考慮它的穩(wěn)定性，活性等問(wèn)題。如pH值、溫度等都會(huì)產(chǎn)生較大的影響，這是生化分離絕不能忽視的。否則，我們將不能得到預(yù)期的效果。
5. 正相色譜與反相色譜
正相色譜是指固定相的極性高于流動(dòng)相的極性，因此，在這種層析過(guò)程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動(dòng)的速度快，先從柱中流出來(lái)。
反相色譜是指固定相的極性低于流動(dòng)相的極性，在這種層析過(guò)程中，極性大的分子比極性小的分子移動(dòng)的速度快而先從柱中流出。
一般來(lái)說(shuō)，分離純化極性大的分子（帶電離子等）采用正相色譜（或正相柱），而分離純化極性小的有機(jī)分子（有機(jī)酸、醇、酚等）多采用反相色譜（或反相柱）。
6. 操作容量（或交換容量）
在一定條件下，某種組分與基質(zhì)（固定相）反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量，我們稱為操作容量（或交換容量）。它的單位是毫摩爾（或毫克）/克（基質(zhì)）或毫摩爾（或毫克）/毫升（基質(zhì)），數(shù)值越大，表明基質(zhì)對(duì)該物質(zhì)的親合力越強(qiáng)。應(yīng)當(dāng)注意，同一種基質(zhì)對(duì)不同種類分子的操作容量是不相同的，這主要是由于分子大�。�空間效應(yīng)）、帶電荷的多少、溶劑的性質(zhì)等多種因素的影響。因此，實(shí)際操作時(shí)，加入的樣品量要盡量少些，特別是生物大分子，樣品的加入量更要進(jìn)行控制，否則用層析辦法不能得到有效的分離。


層析法的分類
層析根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)可以分為多種類型:
1. 根據(jù)固定相基質(zhì)的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。紙層析是指以濾紙作為基質(zhì)的層析。薄層層析是將基質(zhì)在玻璃或塑料等光滑表面鋪成一薄層，在薄層上進(jìn)行層析。柱層析則是指將基質(zhì)填裝在管中形成柱形，在柱中進(jìn)行層析。紙層析和薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測(cè)分析和少量分離制備，通常為一次性使用，而柱層析是常用的層析形式，適用于樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。
2. 根據(jù)流動(dòng)相的形式分類，層析可以分為液相層析和氣相層析。氣相層析是指流動(dòng)相為氣體的層析，而液相層析指流動(dòng)相為液體的層析。氣相層析測(cè)定樣品時(shí)需要?dú)饣�，大大限制了其在生化領(lǐng)域的應(yīng)用，主要用于氨基酸、核酸、糖類、脂肪酸等小分子的分析鑒定。而液相層析是生物領(lǐng)域最常用的層析形式，適于生物樣品的分析、分離。
3. 根據(jù)分離的原理不同分類，層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、親和層析等。
吸附層析是以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)。
分配層析是根據(jù)在一個(gè)有兩相同時(shí)存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)。
凝膠過(guò)濾層析是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。
離子交換層析是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。
親和層析是根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力（如酶和抑制劑、抗體和抗原、激素和受體等），將某種配體連接在載體上作為固定相，而對(duì)能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。親和層析是分離生物大分子最為有效的層析技術(shù)，具有很高分辨率。


柱層析的基本裝置及基本操作
目前，最常用的層析類型是各種柱層析，下面就簡(jiǎn)述柱層析的基本裝置及操作方法，薄層層析的裝置和操作將在后面詳細(xì)討論。
1. 柱層析的基本裝置
柱層析的基本裝置示意圖如圖3－3 所示：


2. 柱層析的基本操作
柱層析的基本操作包括以下一些步驟：
⑴ 裝柱
柱子裝的質(zhì)量好與差，是柱層析法能否成功分離純化物質(zhì)的關(guān)鍵步驟之一。一般要求柱子裝的要均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡等。否則要重新裝柱。
首先選好柱子，根據(jù)層析的基質(zhì)和分離目的而定。一般柱子的直徑與長(zhǎng)度比為1:10~50；凝膠柱可以選1:100~200，同時(shí)將柱子洗滌干凈。
將層析用的基質(zhì)（如吸附劑、樹脂、凝膠等）在適當(dāng)?shù)娜軇┗蚓彌_液中溶脹，并用適當(dāng)濃度的酸（0.5N~1N）、堿（0.5N~1N）、鹽（0.5M~1M）溶液洗滌處理，以除去其表面可能吸附的雜質(zhì)。然后用去離子水（或蒸餾水）洗滌干凈并真空抽氣（吸附劑等與溶液混合在一起），以除去其內(nèi)部的氣泡。
關(guān)閉層析柱出水口，并裝入1/3柱高的緩沖液，并將處理好的吸附劑等緩慢地倒入柱中，使其沉降約3cm高。
打開出水口，控制適當(dāng)流速，使吸附劑等均勻沉降，并不斷加入吸附劑溶液。（吸附劑的多少根據(jù)分離樣品的多少而定。）注意不能干柱、分層，否則必須重新裝柱。
最后使柱中基質(zhì)表面平坦并在表面上留有2~3cm高的緩沖液，同時(shí)關(guān)閉出水口。（采用機(jī)械化裝柱法在此省略。）
⑵ 平衡
柱子裝好后，要用所需的緩沖液（有一定的pH和離子強(qiáng)度）平衡柱子。用恒流泵在恒定壓力下走柱子（平衡與洗脫時(shí)的壓力盡可能保持相同）。平衡液體積一般為3~5倍柱床體積，以保證平衡后柱床體積穩(wěn)定及基質(zhì)充分平衡。如果需要，可用蘭色葡聚糖2000在恒壓下走柱，如色帶均勻下降，則說(shuō)明柱子是均勻的。有時(shí)柱子平衡好后，還要進(jìn)行轉(zhuǎn)型處理。這方面的內(nèi)容在離子交換層析中加以介紹。
⑶ 加樣
加樣量的多少直接影響分離的效果。一般講，加樣量盡量少些，分離效果比較好。通常加樣量應(yīng)少于20%的操作容量，體積應(yīng)低于5%的床體積，對(duì)于分析性柱層析，一般不超過(guò)床體積的1%。當(dāng)然，最大加樣量必須在具體條件下多次試驗(yàn)后才能決定。
應(yīng)注意的是，加樣時(shí)應(yīng)緩慢小心地將樣品溶液加到固定相表面，盡量避免沖擊基質(zhì)，以保持基質(zhì)表面平坦。詳細(xì)操作見層析實(shí)驗(yàn)。
⑷ 洗脫
當(dāng)我們選定好洗脫液后，洗脫的方式可分為簡(jiǎn)單洗脫、分步洗脫和梯度洗脫三種。
簡(jiǎn)單洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過(guò)程結(jié)束為止。如果被分離物質(zhì)對(duì)固定相的親合力差異不大，其區(qū)帶的洗脫時(shí)間間隔（或洗脫體積間隔）也不長(zhǎng)，采用這種方法是適宜的。但選擇的溶劑必須很合適方能使各組分的分配系數(shù)較大。否則應(yīng)采用下面的方法。
分步洗脫：這種方法按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液，進(jìn)行逐級(jí)洗脫。它主要對(duì)混合物組成簡(jiǎn)單、各組分性質(zhì)差異較大或需快速分離時(shí)適用。每次用一種洗脫液將其中一種組分快速洗脫下來(lái)。
梯度洗脫：當(dāng)混合物中組分復(fù)雜且性質(zhì)差異較小時(shí)，一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續(xù)增加的，梯度可以指濃度、極性、離子強(qiáng)度或pH值等。最常用的是濃度梯度。在水溶液中，亦即離子強(qiáng)度梯度�？尚纬商荻鹊男问接腥�種，如圖3－4 所示（以鹽濃度梯度為例）：


我們可以通過(guò)下式計(jì)算得到流經(jīng)層析柱的洗脫液中鹽濃度的計(jì)算公式：

C = CB - ( CB - CA ) ( 1 - V2 / V1 )B1 / A1

式中： C ：流經(jīng)層析柱的洗脫液的鹽濃度
CB ：梯度混合器中B 瓶的鹽濃度（不攪拌）
CA ：梯度混合器中A 瓶的鹽濃度（攪拌）
B1 ：B 瓶的橫切面積
A1 ：A 瓶的橫切面積
V2 ：流經(jīng)層析柱的洗脫液體積
V1 ：梯度洗脫液總體積

洗脫條件的選擇，也是影響層析效果的重要因素。當(dāng)對(duì)所分離的混合物的性質(zhì)了解較少時(shí)，一般先采用線性梯度洗脫的方式去嘗試，但梯度的斜率要小一些，盡管洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，但對(duì)性質(zhì)相近的組分分離更為有利。同時(shí)還應(yīng)注意洗脫時(shí)的速率。前面我們已經(jīng)談到，流速的快慢將影響理論塔板高度，從而影響分辨率。事實(shí)上，速度太快，各組分在固液兩相中平衡時(shí)間短，相互分不開，仍以混合組分流出。速度太慢，將增大物質(zhì)的擴(kuò)散，同樣達(dá)不到理想的分離效果。只有多次試驗(yàn)才會(huì)得到合適的流速�？傊�，我們必須經(jīng)過(guò)反復(fù)的試驗(yàn)與調(diào)整（可以用正交試驗(yàn)或優(yōu)選法），才能得到最佳的洗脫條件。還應(yīng)強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是，在整個(gè)洗脫過(guò)程中，千萬(wàn)不能干柱，否則分離純化將會(huì)前功盡棄。
⑸ 收集、鑒定及保存
在生化實(shí)驗(yàn)中，基本上我們都是采用部分收集器來(lái)收集分離純化的樣品。由于檢測(cè)系統(tǒng)的分辨率有限，洗脫峰不一定能代表一個(gè)純凈的組分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分離的物質(zhì)性質(zhì)很相近，可低至0.5ml / 管。這視具體情況而定。在合并一個(gè)峰的各管溶液之前，還要進(jìn)行鑒定。例如，一個(gè)蛋白峰的各管溶液，我們要先用電泳法對(duì)各管進(jìn)行鑒定。對(duì)于是單條帶的，認(rèn)為已達(dá)電泳純，合并在一起。其他的另行處理。對(duì)于不同種類的物質(zhì)采用相應(yīng)的鑒定方法，在這里不再敘述。最后，為了保持所得產(chǎn)品的穩(wěn)定性與生物活性，我們一般采用透析除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮，再冰凍干燥，得到干粉，在低溫下保存?zhèn)溆谩?
⑹ 基質(zhì)（吸附劑、交換樹脂或凝膠等）的再生
許多基質(zhì)（吸附劑、交換樹脂或凝膠等）可以反復(fù)使用多次，而且價(jià)格昂貴，所以層析后要回收處理，以備再用，嚴(yán)禁亂倒亂扔。這也是一個(gè)科研工作者的科學(xué)作風(fēng)問(wèn)題。各種基質(zhì)的再生方法可參閱具體層析實(shí)驗(yàn)及有關(guān)文獻(xiàn)