離心是蛋白質(zhì)、酶、核酸及細(xì)胞亞組分分離的最常用的方法之一，也是生化實(shí)驗(yàn)室中常用的分離、純化或澄清的方法。尤其是超速冷凍離心已經(jīng)成為研究生物大分子實(shí)驗(yàn)室中的常用技術(shù)方法。
離心機(jī)(centrifuge)是實(shí)施離心技術(shù)的裝置。離心機(jī)的種類很多，按照使用目的，可分為兩類，即制備型離心機(jī)和分析型離心機(jī)。前者主要用于分離生物材料，每次分離樣品的容量比較大，后者則主要用于研究純品大分子物質(zhì)，包括某些顆粒體如核蛋白體等物質(zhì)的性質(zhì)，每次分析的樣品容量很小，根據(jù)待測物質(zhì)在離心場中的行為(可用離心機(jī)中的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)地監(jiān)測)，能推斷其純度、形狀和相對分子質(zhì)量等性質(zhì)。這兩類離心機(jī)由于用途不同，故其主要結(jié)構(gòu)也有差異。

離心原理
將樣品放入離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的離心管內(nèi)，離心機(jī)驅(qū)動(dòng)時(shí)，樣品液就隨離心管做勻速圓周運(yùn)動(dòng)，于是就產(chǎn)生了一個(gè)向外的離心力。由于不同顆粒的質(zhì)量、密度、大小及形狀等彼此各不相同，在同一固定大小的離心場中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互間的分離。
離心力和相對離心力
溶液中的固相顆粒做圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生一個(gè)向外離心力，其定義為：
F = mω2r
式中：
F 為離心力的強(qiáng)度； m 為沉降顆粒的有效質(zhì)量；
ω 為離心轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)的角速度，其單位為rad/s；
r 為離心半徑(cm)，即轉(zhuǎn)子中心軸到沉降顆粒之間的距離。
很顯然，離心力隨著轉(zhuǎn)速和顆粒質(zhì)量的提高而加大，而隨著離心半徑的減小而降低。目前離心力通常以相對離心力Fcf 表示，即離心力F 的大小相對于地球引力(G)的多少倍，單位為g，其計(jì)算公式如下：
Fcf = 1.119×105(h)2r×g
可以看出，在同一轉(zhuǎn)速下，由于f 的不同，F(xiàn)cf相差會很大，實(shí)際應(yīng)用時(shí)一般取平均值。在離心實(shí)驗(yàn)的報(bào)告中，F(xiàn)cf、r 平均、離心時(shí)間t 和液相介質(zhì)等條件都應(yīng)表示出來，因?yàn)樗鼈兌寂c樣品的沉降速度有直接的聯(lián)系。顯然Fcf是一個(gè)只與離心機(jī)相關(guān)的參數(shù)，而與樣品并無直接的關(guān)系。
沉降速度與沉降系數(shù)
一個(gè)顆粒要沉降，它必須置換出位于它下方等體積的溶液，這只有當(dāng)顆粒的質(zhì)量大于被置換出的液體的質(zhì)量時(shí)才能通過離心的手段達(dá)到，否則，在離心過程中顆粒將發(fā)生向上漂浮，而不是下沉。當(dāng)顆粒在運(yùn)動(dòng)時(shí)，不論方向如何，它都要穿過溶劑分子，所產(chǎn)生的摩擦力總是與顆粒運(yùn)動(dòng)的方向相反。
摩擦力的大小與顆粒的運(yùn)動(dòng)速度成正比，并且受顆粒的大小、形狀及介質(zhì)性質(zhì)的影響：

式中：
f 為顆粒在濟(jì)劑中的摩擦系數(shù)．與顆粒的大小、形狀及介質(zhì)性質(zhì)相關(guān)；
v 為顆粒的沉降速度。
由于離心力的存在，顆粒將加速運(yùn)動(dòng)直到摩擦力與離心力相等。在這種情況下，顆粒所受到的凈作用力為零，顆粒將以最大速度運(yùn)動(dòng)。

式中 Mp 和M s 分別為顆粒的質(zhì)量及等體積的溶劑的質(zhì)量。
上式中的Mp 和M s 很難確定，為了建立分子大小與沉降系數(shù)之間的關(guān)系，引入了沉降系數(shù)這一新的概念。沉降系數(shù)定義為沉降速度與離心力的比率或單位離心場中顆粒的沉降速度，它以svedberg單位計(jì)算，1S＝1×10-13 s。例如，核糖核酸酶A 的沉降系數(shù)為1．85×10-13 s，即可記作1．85S。
近年來，在生物化學(xué)、分子生物學(xué)及生物工程等書刊文獻(xiàn)中，對于某些大分子化合物，當(dāng)它們的詳細(xì)結(jié)構(gòu)和分子量不很清楚時(shí)，常常用沉降系數(shù)這個(gè)概念去描述它們的大小。如核糖體RNA(rRNA)有30 s 亞基和50s 亞基，這里的s 就是沉降系數(shù)，現(xiàn)在更多地用于生物大分子的分類，特別是核酸。
離心技術(shù)的類型

最大速度方法
(1)移動(dòng)界面超速離心法
含幾個(gè)組分的樣品在足夠高的離心場中離心時(shí)，每種顆粒都達(dá)到其最大沉降速度，這時(shí)樣品開始分離。離心管的上層逐漸形成透明的上清液，并形成對應(yīng)于樣品各組分的一系列濃度界面，界面的移動(dòng)相對于每種組分來說是特征的。

雖然利用這種方法不一定能實(shí)現(xiàn)組分的純化分離，但可以通過監(jiān)測界面的移動(dòng)來測定各組分的沉降速度。要想實(shí)現(xiàn)組分間的分離，必須在所需樣品沉降之后停止離心過程。沉積的樣品再懸浮到新的溶劑中，并以較低的速度離心使大顆粒的污染物沉降，而被純化的樣品留在溶液中，經(jīng)過反復(fù)多次地離心才能得到純的樣品，這種方法就叫差示沉降離心法，它對細(xì)胞組分間的分離非常有用。也可以通過逐漸增大轉(zhuǎn)速的方法實(shí)現(xiàn)不同組分間的分離，

細(xì)胞勻漿差示分離
(a)細(xì)胞勻漿；(b)細(xì)胞碎片；(c)線粒體、過氧化物酶體、溶酶體；(d)微粒體、核糖體；(e)細(xì)胞液；(可溶性蛋白質(zhì)及小分子生物)
(2)移動(dòng)區(qū)帶超速離心法
差示離心法離心前各組分均勻分布在整個(gè)溶液中，所以分離一般不理想，而移動(dòng)區(qū)帶超速離心法是一種密度梯度(Dens 心Gradient)離心技術(shù)，在離心之前離心管中溶液的密度不同(從上到下密度增大)，梯度介質(zhì)中最大密度應(yīng)小于樣品物質(zhì)的最小密度，其特點(diǎn)是物質(zhì)的分離取決于樣品物質(zhì)顆粒的質(zhì)量．即樣品物質(zhì)的沉降系數(shù)，而不是取決于樣品物質(zhì)的密度，因而適合于分離密度相近而大小和形狀不同的物質(zhì)，這屬于一種非平衡態(tài)分離法。當(dāng)樣品物質(zhì)輕輕地鋪在密度梯度介質(zhì)的液面上，起動(dòng)離心機(jī)，在離心力的作用下，一定時(shí)間后便形成不同物質(zhì)的區(qū)帶。當(dāng)繼續(xù)離心時(shí)每個(gè)區(qū)帶會逐一達(dá)到管底，所以，在沉降最快的區(qū)帶到達(dá)管底之前要停止離心，并將每個(gè)區(qū)帶分部收集。最常用的制備密度梯度的化合物有蔗糖、甘油、氯化銫和硫酸銫等。
等密度方法
等密度離心法也叫沉降平衡法。所謂等密度是指樣品密度與介質(zhì)的密度相等，實(shí)際上是在梯度密度介質(zhì)中進(jìn)行的。該技術(shù)的特點(diǎn)是沉降分離與樣品物質(zhì)的大小和形狀無關(guān)，而取決于樣品物質(zhì)的密度。這種方法非常類似于電泳中的PH 梯度等電聚焦方法，在離心時(shí)，顆粒依其密度的不同沉降或向上漂浮，直到移動(dòng)到與自身的密度相同的溶劑梯度中為止，其結(jié)果是依樣品物質(zhì)密度的不同在梯度溶劑中形成一個(gè)個(gè)區(qū)帶。
在實(shí)驗(yàn)方法上可以采用預(yù)先制備密度梯度溶液的方法，一般先制備兩種儲備液，它們的濃度決定最終所形成梯度溶液的極限�？梢酝ㄟ^分步減小密度，從離心管底部到上部逐漸加液的方式形成不連續(xù)梯度溶液，也可以通過一個(gè)梯度混合器產(chǎn)生連續(xù)梯度密度。儲備液一般使用兩種密度的蔗糖溶液或兩種密度的氯化銫溶液來制備。樣品一般鋪在溶液的表面，然后開始離心。
在實(shí)驗(yàn)方法上也可以采用平衡密度梯度法，在這種離心法中，介質(zhì)的梯度不是預(yù)先配制，而是在離心過程中，由于離心力的作用而逐漸形成。樣品物質(zhì)和氯化銫的濃鹽溶液充分混合均勻，離心開始之后，銫鹽由于離心力的作用，自離心管口至離心管底形成連續(xù)遞增的密度梯度。生物樣品中不同組分物質(zhì)在離心過程中沉降或上浮以尋找與自身密度相同的溶液密度梯度區(qū)帶，不同的物質(zhì)最終到達(dá)相應(yīng)的區(qū)帶，從而實(shí)現(xiàn)分離。這種方法依賴于在離心場的作用下低分子量的銫鹽密度梯度的形成，一般需要長時(shí)間的離心(2~3天)。顯然，樣品物質(zhì)的密度應(yīng)介于介質(zhì)梯度中最大和最小密度之間，否則，樣品將沉到離心管的底部或漂浮到溶液的頂層。
無論是采用哪種操作方式，最終都要分別收集處在每一區(qū)帶的樣品組分，一般可采用下述兩種方法實(shí)現(xiàn)：
(1)穿刺法
這是方便而又理想的部分收集方法。用一根金屬空心針從離心管底刺人管內(nèi)，不同區(qū)帶內(nèi)的組分自下而上地先后從針管內(nèi)分別流出，然后用部分收集器分別收集。
(2)取代法
在離心管口加一個(gè)帶有收集導(dǎo)管的塞子，塞子上同時(shí)裝有一根輸液導(dǎo)管插入離心管的管底，從輸液管中注入高密度的離心介質(zhì)．其密度高于離心管中所形成的最大密度。當(dāng)取代液不斷注入時(shí)離心管中的溶液逐漸上升，并不斷從收集導(dǎo)管中流出，然后用部分收集器分別收集。
離心機(jī)類型
通常所使用的離心機(jī)根據(jù)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速大小的不同可分為普通離心機(jī)、高速離心機(jī)和超速離心機(jī)三類。
(1)普通離心機(jī)
一般來說，最大轉(zhuǎn)速不超過6000r／min 者屬普通離心機(jī)；如國產(chǎn)的80—1型，LXJ—Ⅱ型等。離心機(jī)轉(zhuǎn)速與相對離心力的測算，如圖2—37。
普通離心機(jī)轉(zhuǎn)子在室溫下運(yùn)轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)子室內(nèi)的溫度一般無法控制，轉(zhuǎn)子有固定角度式和懸掛吊格式。
離心時(shí)形成的固體沉淀層叫壓板，液相部分稱之為上層清液。用傾注法分離兩相。
(2)高速離心機(jī)
轉(zhuǎn)速可以達(dá)到25000r／min 者為高速離心機(jī)；轉(zhuǎn)速在25000r／min 以上者為超速離心機(jī)。高速離心機(jī)一般帶有制冷裝置，因而轉(zhuǎn)子室內(nèi)的溫度可以控制。轉(zhuǎn)子室內(nèi)的溫度一般控制在4℃為宜。。其中大容量連續(xù)流動(dòng)離心機(jī)的主要用途是從大量培養(yǎng)物(5~500 L)中收集酵母及細(xì)菌等。另一類是低容量冰凍離心機(jī)，型號甚多，其最大容量可達(dá)3L。這類離心機(jī)有各種內(nèi)部可變換的角式和甩平式轉(zhuǎn)頭，它們多用于收集微生物、細(xì)胞碎片、細(xì)胞、大的細(xì)胞器、硫酸銨沉淀物、免疫沉淀物酶的粗提液等。特別需注意的是，每次離心前，應(yīng)根據(jù)轉(zhuǎn)頭型號和樣品多少，設(shè)置樣品高度。
(3)超高速離心機(jī)
普通和高速離心機(jī)主要用于分離制備生物大分子物質(zhì)和亞細(xì)胞成分；超速離心機(jī)有超過500000×g的離心力，能使亞細(xì)胞器分級分離，可用于分離病毒，也可用于測定蛋白質(zhì)、核酸的相對分子質(zhì)量等。
根據(jù)功能不同，又可分制備性超速離心機(jī)和分析性超速離心機(jī)。
由于轉(zhuǎn)速高會產(chǎn)生大量的熱量，因而這種離心機(jī)都附有冷凍裝置，以降低轉(zhuǎn)子室內(nèi)溫度。同時(shí)．轉(zhuǎn)子是在真空下運(yùn)轉(zhuǎn)的，可以減小摩擦。分析性離心時(shí)，必須對固相顆粒沉降過程跟蹤監(jiān)測。為此，超速離心機(jī)附有一套光學(xué)系統(tǒng)，光路與離心管垂直，并透過離心管內(nèi)的溶液，同時(shí)測定光密度或透光率，也可以檢測沉降顆粒的沉降速度和移動(dòng)界面。這些測定有助于對樣品的狀況進(jìn)行分析。

①制備性超速離心機(jī)：
主要由驅(qū)動(dòng)和速度控制、溫度控制、真空系統(tǒng)和轉(zhuǎn)頭四部分組成。
驅(qū)動(dòng)和速度控制：大多數(shù)超速離心機(jī)的驅(qū)動(dòng)裝置是由水冷或風(fēng)冷電動(dòng)機(jī)通過精密齒輪箱或皮帶變速，或直接用變頻馬達(dá)連接到轉(zhuǎn)頭軸構(gòu)成。由于驅(qū)動(dòng)軸的直徑僅僅0.476cm，這樣，在旋轉(zhuǎn)期間細(xì)軸可有一定的彈性彎曲，以便適應(yīng)轉(zhuǎn)頭的輕度不平衡，而不至于引起震動(dòng)或轉(zhuǎn)鈾損傷。利用變阻器和帶有旋速器的控制器來選擇轉(zhuǎn)頭的轉(zhuǎn)速。除速度控制系統(tǒng)以外，還有一個(gè)過速保護(hù)系統(tǒng)，以防止轉(zhuǎn)速超過轉(zhuǎn)頭最大規(guī)定轉(zhuǎn)速時(shí)引起的轉(zhuǎn)頭撕裂或爆炸。為此目的，離心腔總是用能承受此種爆炸的裝甲鋼板密閉。
溫度控制：其溫度控制是由安置在轉(zhuǎn)頭下面的紅外線射量感受器直接而連續(xù)地監(jiān)測轉(zhuǎn)頭的溫度，以保證更準(zhǔn)確更靈敏的溫度調(diào)控。

真空系統(tǒng)：當(dāng)轉(zhuǎn)速超過4000 r／min 時(shí)，空氣與旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)軸之間的摩擦生熱成為嚴(yán)重的問題。為了消除這種熱源．超速離心機(jī)一般增添了真空系統(tǒng)。將離心腔密封，并通過兩個(gè)串聯(lián)工作的真空泵系統(tǒng)抽成真空。第一個(gè)工作泵與一般實(shí)驗(yàn)室的機(jī)械真空泵相同，它可抽真空到13．33~666Pa。一旦離心腔內(nèi)的壓力減低到33．33Pa 以下，水冷擴(kuò)散泵也開始工作。利用這兩個(gè)泵，可使真空度達(dá)到并維持在0．13~0．26Pa。在摩擦力降低的情況下，速度才有可能升高到所需的轉(zhuǎn)數(shù)。

轉(zhuǎn)頭：制備性超速離心機(jī)采用的轉(zhuǎn)頭有各種各樣．一般可分為兩大類：角式轉(zhuǎn)頭和甩平式轉(zhuǎn)頭。角式轉(zhuǎn)頭的孔穴與旋轉(zhuǎn)軸心之間的角度在20~45度之間。這類轉(zhuǎn)頭的優(yōu)點(diǎn)是具有較大的容量，速度較高。另一種甩平式轉(zhuǎn)頭則由一個(gè)轉(zhuǎn)頭上懸吊著6個(gè)自由活動(dòng)的吊桶〔離心管套〕構(gòu)成。當(dāng)轉(zhuǎn)頭靜止時(shí)，這些吊柄垂直懸掛；當(dāng)轉(zhuǎn)頭在離心力的作用下轉(zhuǎn)速達(dá)到200～800 r／min 時(shí)．吊桶即甩平到水平位置。

這種轉(zhuǎn)頭主要是為了密度梯度沉降法而設(shè)計(jì)的。其主要優(yōu)點(diǎn)是梯度物質(zhì)可放在保持垂直的離心管中，而離心時(shí)管子保持水平。在水平位置沉降到離心管不同區(qū)域的樣品呈現(xiàn)出橫過離心管的帶狀，而不像角式轉(zhuǎn)頭中那樣成角度。因此，當(dāng)從轉(zhuǎn)頭中取出離心管時(shí)．不會像在角式轉(zhuǎn)頭中那樣，沉降成分重新定位。這類轉(zhuǎn)頭的缺點(diǎn)是：形成區(qū)帶所需的時(shí)間間矩長，②分析性超速離心機(jī)分析性超速離心機(jī)使用了特殊設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)頭和檢測系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場的沉降過程。

分析性超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭是橢圓形的，此轉(zhuǎn)頭通過一個(gè)有天性的軸聯(lián)接到一個(gè)高速的驅(qū)動(dòng)裝置上。轉(zhuǎn)頭在一個(gè)冷凍的和真空的膠中旋轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)頭上有2~6個(gè)裝離心杯的小室，離心杯呈扇形，可上下透光。離心機(jī)中裝有一個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，在整個(gè)離心期間都能通過紫外吸收或折射率的變化監(jiān)測離心杯中沉降著的物質(zhì)。在預(yù)定的時(shí)間可以拍攝沉降物質(zhì)的照片、杯中物質(zhì)沉降過程中，重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個(gè)折射的透鏡，在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)生了一個(gè)”峰”，出于沉降不斷進(jìn)行，界面問前推進(jìn)，因此峰也移動(dòng)。從峰移動(dòng)的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標(biāo)。
分析性超速離心機(jī)主要用于生物大分子的相對分子質(zhì)量測定，估算樣艙的純度和檢測生物大分子構(gòu)象的變化等。