激光掃描共聚焦顯微鏡在細胞凋亡研究中的應用
摘要
激光掃描共聚焦顯微鏡作為80年代發(fā)展起來的一種高精度分子細胞生物學分析儀器，具有組織細胞斷層掃描、活細胞動態(tài)熒光監(jiān)測、三維圖像重建、共聚焦圖像定量分析等先進功能，在近年的細胞凋亡這一研究熱點中得到了大量創(chuàng)造性的應用。本文擬就對激光掃描共聚焦顯微鏡在凋亡的形態(tài)學、分子水平變化及重要生理過程三方面研究中的應用及其成果做一綜述。
關鍵詞 激光掃描共聚焦顯微鏡 凋亡
細胞凋亡(apoptosis)是不同于細胞壞死的一種細胞主動死亡方式，并由特定的基因控制。凋亡細胞在形態(tài)上出現(xiàn)變圓皺縮、染色質濃縮邊集、核碎裂、凋亡小體形成等變化，并最終由非炎癥過程清除。由于細胞凋亡獨特地影響著機體的細胞發(fā)育和代謝，在監(jiān)測和清除腫瘤細胞與突變細胞等方面也可能發(fā)揮重要的作用，近年來受到了細胞生物學、分子生物學、免疫學等多學科的廣泛關注。
激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy,
LSCM)是80年代發(fā)展起來的一種高精度分子細胞生物學分析儀器，輔以各類免疫熒光探針或熒光染料與被測物質特異性結合，不僅可觀察固定的細胞組織切片，還可對活細胞的結構、分子和離子進行實時動態(tài)地觀察和檢測[1]。在細胞凋亡的研究中，激光掃描共聚焦顯微鏡已被廣泛地應用于形態(tài)學、分子水平監(jiān)測及重要生理改變等各方面，其中不乏新穎之處，并獲得了大量成果，以下將就此做一簡單的介紹。
（生物秀儀器頻道 ）
激光掃描共聚焦顯微鏡與凋亡的形態(tài)學
激光掃描共聚焦顯微鏡用點光源掃描標本的光學橫斷面，以代替普通光學顯微鏡所使用的場光源，并用探測針孔濾去離焦光線，所以消除了來自焦平面以外的衍射或散射光的干擾，可實現(xiàn)高清晰、高分辨率的組織細胞斷層掃描[2]。并且由于激光掃描共聚焦顯微鏡采用數(shù)字化成像，因而輔以一定的軟件就能對圖像進行定量分析及三維重建等操作。過去對細胞凋亡的形態(tài)學研究方法局限于活性細胞和組織切片染色、熒光鏡觀察，或者石蠟切片原位末端標記法。由于普通光鏡的分辨率和清晰度有限，而電鏡又顯然不適合對凋亡這一復雜動態(tài)過程的監(jiān)測，激光掃描共聚焦顯微鏡的應用使人們對細胞凋亡的形態(tài)學觀察分析提高到了一個前所未有的新水平。
細胞核
核膜的破壞對于染色質聚集并形成凋亡小體起重要作用。lamin是構成核片層的蛋白質，位于核膜的內表面，由caspase-6介導的lamin裂解可影響核膜的完整性[3]。在McCall等[4]的研究中，對果蠅卵子發(fā)生晚期的細胞凋亡現(xiàn)象進行了動態(tài)觀察。以單抗mAb101標記其哺育細胞核內膜的lamin
Dm0（哺乳類lamin B的同源體），用激光掃描共聚焦顯微鏡加以觀察。正常哺育細胞到11期（stage
11）時，染色的lamin呈彌散的霧狀分布并圍繞核周，而dcp-1
GLC哺育細胞即使到了較晚的14期時，仍然顯示界線明確的染色�？梢奷cp-1突變體在核lamin蛋白的酶切或解聚方面存在缺陷。
細胞器
Li 等[5]在對C(6)-�；拾贝颊T導胞內囊泡產(chǎn)生的研究中，在不產(chǎn)生中毒效應的情況下，加入10microM C(6)-酰基鞘氨醇以誘導鼠纖維母細胞
(3T3-L1和3T3-F442A)
凋亡。觀察到囊泡的形成與C(6)-�；拾贝嫉恼T導呈時間依從和劑量依從關系。大量小泡在其加入后8小時內出現(xiàn)，并且隨時間而增大；大泡最終分布在核周，而小泡分布在細胞邊緣。用抗-溶酶體膜蛋白抗體和共聚焦免疫熒光顯微分析，證明增大的囊泡為晚期內吞體/溶酶體。另外，胞內的細胞器都有其適用的熒光探針，如高爾基復合體常用的探針有NBD
ceramide、BODIPY ceramide等，內質網(wǎng)常用的有Dil、DiOC6等[6]，經(jīng)標記均可進行精細的觀察。
當然，激光掃描共聚焦顯微鏡在形態(tài)學中的優(yōu)勢更在于其對圖像的三維重建功能，從而揭示過去只能在平面上顯現(xiàn)的凋亡細胞在三維空間中的結構；而對細胞凋亡的動態(tài)過程，它可以用三維加時間的四維方式進行觀察，來獲取最逼真的形態(tài)學資料。凋亡過程中一些特征性的三維形態(tài)變化正期待著進一步具體的工作去發(fā)現(xiàn)。
激光掃描共聚焦顯微鏡對凋亡細胞的分子水平監(jiān)測
隨著分子生物學突飛猛進的發(fā)展，關于細胞凋亡分子機制的研究已有了很大的突破。細胞凋亡的信號傳遞途徑及其調控涉及到大量的酶級聯(lián)反應、生物大分子的空間轉移等。而激光掃描共聚焦顯微鏡以其定性、定量、定時的優(yōu)點，結合眾多熒光探針的應用，成為了研究細胞凋亡分子水平變化的有力手段。
DNA
大分子DNA斷裂以及染色質的異常凝聚，是細胞凋亡的關鍵[7]，同時也是細胞核在細胞凋亡中具有標志性的變化。Columbara等[8]報道將激光掃描共聚焦顯微鏡與原位TdT和Pol
I免疫熒光技術相結合，進而確定雙鏈和單鏈DNA的斷裂點。而在對細胞凋亡和細胞壞死區(qū)別的研究中[9]，Kressel等在培養(yǎng)的K562細胞中加入放線菌素D以誘導凋亡，并對細胞的DNA片段進行了3’-末端標記。經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)K562細胞凋亡早期有大量DNA片段出現(xiàn)，且DNA片段彌散分布于除核仁外的細胞核區(qū)。伴隨著凋亡的進展，細胞核內出現(xiàn)大量高標記密度的圓形小體。而采用NaN3或快速凍融法使細胞壞死，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察證實，在壞死開始階段并無DNA片段的出現(xiàn)，至少在壞死發(fā)生24小時后才有DNA片段產(chǎn)生。
Caspase家族
Caspases是一組高度保守的半胱氨酸蛋白酶，目前發(fā)現(xiàn)有11個成員。多數(shù)細胞凋亡是以Caspase家族蛋白的激活并作用于其關鍵底物而實現(xiàn)的，而caspases激活的關鍵又在于該家族蛋白間的級聯(lián)反應[10]，因此caspases被認為是細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者，成為研究的熱點。
Mandal等[11]用激光掃描共聚焦顯微鏡對細胞凋亡中激活的caspase-3的重分布進行了研究。用丁酸處理細胞后，觀察到DNA-PKcs的裂解與caspase-3的激活成正相關，而Bcl-2的過度表達則可抑制上述兩個過程。同時還證明（1）激活后的caspase-3重分布到核區(qū)，（2）裂解局部的DNA-PKcs和PARP（polyADP-ribose
polymerase，聚腺苷二磷酸核糖多聚酶），（3）裂解產(chǎn)物又被釋放到核外的細胞液。caspase-3的抑制物四肽DEVD-CHO又可抑制上述的三個連續(xù)的步驟。該研究提示：激活的caspase-3在核內的重分布構成了丁酸所誘導的細胞凋亡中的一個重要凋亡信號。
（生物秀儀器頻道 ）
另外，在用激光掃描共聚焦顯微鏡對Q79誘導大鼠神經(jīng)元凋亡的研究[12]中，Sanchez等發(fā)現(xiàn)了Q79對caspase-8的聚集和激活，而對caspase-8的抑制則阻止了被誘導的細胞凋亡；加以Western
blot分析，還建立了caspase-8的激活和某些神經(jīng)退行性疾�。ㄈ缥璧覆。┑穆�(lián)系。
Grazyme
絲氨酸蛋白酶grazyme為另一種重要的凋亡信號分子，對某些caspase家族蛋白也有激活作用。Trapani等[13]就證明了殺傷淋巴細胞利用穿孔素和grazyme
B的協(xié)同作用來誘導靶細胞的凋亡，在其研究中通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到（1）50%細胞的胞核內快速聚集了以FITC熒光標記的grazyme
B（最長7分鐘，t1/2為2分鐘），然后發(fā)生凋亡；（2）其它的細胞只有細胞液內有FITC-grazyme
B的攝取，避免了凋亡。此間至少在13分鐘后才有DNA碎片的出現(xiàn)，說明核內的grazyme B聚集出現(xiàn)在凋亡的執(zhí)行階段之前。并且通過對核內液的處理（加入70KDa
FITC-dextran），間接觀察到grazyme B的轉移并非是因為核膜受caspases的作用而破損，而是由于穿孔素的協(xié)同。
其它
以上的介紹顯示，激光掃描共聚焦顯微鏡在檢測活細胞酶活性動態(tài)變化方面有著突出的優(yōu)勢。實際上，對于細胞凋亡的分子機制這樣一個極其復雜的課題，激光掃描共聚焦顯微鏡的應用遠不只限于上述的幾種離子和大分子，而是滲透到了大量的分枝課題中去。如在對重要的凋亡負調控蛋白Bcl-2的研究中，Beham等[14]利用基因毒性損害（genotoxic
damage）誘導細胞凋亡，并以Bcl-2蛋白抑制其凋亡過程。用激光掃描共聚焦顯微鏡和Immunoblotting觀察顯示，Bcl-2的作用在于阻止了誘導產(chǎn)生的p53蛋白向核內的轉運。而Ohsawa等[15]對獨立于caspase家族的另一種重要蛋白酶—組織蛋白酶進行了研究，用血清剝奪法誘導PC12細胞凋亡，并用激光掃描共聚焦顯微鏡監(jiān)測了其精細超微結構改變過程和細胞內組織蛋白酶B和D的免疫活度的對比變化。又如，在人胰島淀粉樣多肽（hIAPP）的研究中，Hiddinga等[16]用表達hIAPP的質粒轉染COS-1細胞誘導凋亡，輔以免疫組化染色，用激光掃描共聚焦顯微鏡證明了hIAPP在細胞的內質網(wǎng)和高爾基復合體內呈簇狀沉積，并與細胞凋亡成相關關系�？傊�，隨著在凋亡中扮演重要角色的生物大分子的不斷發(fā)現(xiàn)，激光掃描共聚焦顯微鏡的應用還會更為寬廣，成為監(jiān)測生物大分子在時間、空間上動態(tài)分布的重要工具。
激光掃描共聚焦顯微鏡與凋亡中的重要生理過程研究
游離鈣分析
Ca2+在多條信號傳遞通路中發(fā)揮著重要的作用，在細胞凋亡中也不例外。用激光掃描共聚焦顯微鏡輔以鈣熒光探針活體測量[Ca2+]較之傳統(tǒng)方法具有無可比擬的優(yōu)點，如熒光探針易于導入，空間分辨率高，反應速度快，多離子同時測定等[17]。
在對大鼠胸腺細胞凋亡的研究中[18]，采用毒胡蘿卜素誘導細胞凋亡，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡對胞內游離Ca2+信號對胸腺細胞凋亡激活作用的研究發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)細胞凋亡所需毒胡蘿卜素的最低濃度為1µM，而此誘發(fā)過程可被Ca2+螯合劑所阻斷，同時還發(fā)現(xiàn)凋亡核的形成和廣泛的DNA斷裂現(xiàn)象，結果表明毒胡蘿卜素誘導的Ca2+增加信號足以激活胸腺細胞的凋亡。另外，F(xiàn)ang等[19]對高效抗癌化療藥物Harringtonine(HT）快速誘導HL-60細胞凋亡的現(xiàn)象進行研究，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察證實了該凋亡過程中的兩個連續(xù)過程，即Ca2+離子在細胞核內的積聚及其進一步的核內區(qū)域化。
線粒體膜電位測定
激光掃描共聚焦顯微鏡可輔以電位敏感性熒光染料進行間接的膜電位測量。通過測量生物膜兩側的熒光強度，代入Nernst方程即可算得該膜兩側的電位差。因為激光掃描共聚焦顯微鏡能有效地排除非焦平面的熒光，因而較之普通熒光顯微鏡能獲得更為準確的膜內外熒光值，避免了可能產(chǎn)生的嚴重誤差。正是激光掃描共聚焦顯微鏡的這一功能，被應用于細胞凋亡中一熱點問題的探討，即線粒體膜電位改變（MPT）、細胞色素C的釋放與細胞凋亡的關系。
在Heiskanen等人的研究中[20]，應用了四甲基羅丹明甲酯（TMRM）來監(jiān)測線粒體的膜電位。在其實驗中，用staurosporine誘導單個PC-6活細胞的凋亡，同時用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察了細胞色素C的釋放與MPT之間的時間關系。結果在用staurosporine后的2小時到7小時，線粒體膜電位發(fā)生了急劇的下降；并用綠熒光蛋白標記細胞色素C，發(fā)現(xiàn)線粒體膜去極化伴隨細胞色素C的釋放。進而，細胞色素C參加到caspase家族蛋白的激活過程中，使細胞最終走向死亡。另外，Minamikawa等[21]也對線粒體在細胞凋亡中扮演的角色進行了研究，在該實驗中，Mitotracker
Red被用以標記線粒體，它具有極強的光敏化作用和潛在的光毒性。當向胞內加入100nM
該熒光探針后，用激光掃描共聚焦顯微鏡成像，常規(guī)掃描所用的激光束在此時通過Mitotracker
Red產(chǎn)生光毒性誘導線粒體的損傷，同時可見線粒體去極化指示劑羅丹明-123的熒光強度迅速下降，說明線粒體發(fā)生了快速去極化，而殘余的少量Mitotracker
Red則使線粒體在損傷后15分鐘內的球狀腫脹得以顯現(xiàn)；對細胞色素C的免疫組化染色也顯示在上述光照后細胞色素C由線粒體彌散到胞漿中的現(xiàn)象。
結語
在當今生物醫(yī)學的研究中，從分析走向綜合、從靜態(tài)走向動態(tài)、從現(xiàn)象走向本質是一個大趨勢。在細胞凋亡這個誘人課題的研究中，有復雜的生化級聯(lián)反應，有精細交織的信號傳導途徑，有生物膜電位的改變以及最終形態(tài)上的大體變化，激光掃描共聚焦顯微鏡作為一種全新的實驗手段，輔以眾多熒光探針的創(chuàng)造性運用，的確顯示出了強大的生命力。
同時，應該認識到只有選擇合適的熒光探針，才能保證實驗的順利進行并獲得理想的結果。因此，選擇熒光探針時須考慮到：（1）現(xiàn)有儀器所采用的激光器，（2）熒光探針的光穩(wěn)定性和光漂白性，（3）熒光的定性或定量，（4）熒光探針的特異性和毒性，（5）熒光探針適用的PH值[22]。另外，激光掃描共聚焦顯微鏡的有效應用尚需與其它技術聯(lián)合互補，如對膜電位的定量研究中，可用微電極進行膜片鉗記錄或胞內記錄，在測量膜電位同時測量熒光信號，以求出標準曲線[17]。
總而言之，從激光掃描共聚焦顯微鏡在細胞凋亡研究中應用可以展望，這項多功能、高精度、自動化的實驗手段必會在將來的科學研究中發(fā)揮更加重要的作用。
參考文獻
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19. Fang M et al.Cancer Lett, 1998; 127(1-2): 113
20. Heiskanen KM et al. J Biol Chem, 1999; 274(9): 5654
21. Minamikawa T et al. J Cell Sci, 1999; 112(pt 14): 2419
22. Huo X et al. Acta Laser Biology Sinica, 1999; 8(2):152
作者：劉暢等 來源：華西醫(yī)科大學附一院
劉暢 顧玲 綜述 步宏 審校
（華西醫(yī)科大學附一院 移植免疫實驗室，610044）
激光掃描共聚焦顯微鏡作為80年代發(fā)展起來的一種高精度分子細胞生物學分析儀器，具有組織細胞斷層掃描、活細胞動態(tài)熒光監(jiān)測、三維圖像重建、共聚焦圖像定量分析等先進功能，在近年的細胞凋亡這一研究熱點中得到了大量創(chuàng)造性的應用。本文擬就對激光掃描共聚焦顯微鏡在凋亡的形態(tài)學、分子水平變化及重要生理過程三方面研究中的應用及其成果做一綜述。
關鍵詞 激光掃描共聚焦顯微鏡 凋亡
細胞凋亡(apoptosis)是不同于細胞壞死的一種細胞主動死亡方式，并由特定的基因控制。凋亡細胞在形態(tài)上出現(xiàn)變圓皺縮、染色質濃縮邊集、核碎裂、凋亡小體形成等變化，并最終由非炎癥過程清除。由于細胞凋亡獨特地影響著機體的細胞發(fā)育和代謝，在監(jiān)測和清除腫瘤細胞與突變細胞等方面也可能發(fā)揮重要的作用，近年來受到了細胞生物學、分子生物學、免疫學等多學科的廣泛關注。
激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy,
LSCM)是80年代發(fā)展起來的一種高精度分子細胞生物學分析儀器，輔以各類免疫熒光探針或熒光染料與被測物質特異性結合，不僅可觀察固定的細胞組織切片，還可對活細胞的結構、分子和離子進行實時動態(tài)地觀察和檢測[1]。在細胞凋亡的研究中，激光掃描共聚焦顯微鏡已被廣泛地應用于形態(tài)學、分子水平監(jiān)測及重要生理改變等各方面，其中不乏新穎之處，并獲得了大量成果，以下將就此做一簡單的介紹。
（生物秀儀器頻道 ）
激光掃描共聚焦顯微鏡與凋亡的形態(tài)學
激光掃描共聚焦顯微鏡用點光源掃描標本的光學橫斷面，以代替普通光學顯微鏡所使用的場光源，并用探測針孔濾去離焦光線，所以消除了來自焦平面以外的衍射或散射光的干擾，可實現(xiàn)高清晰、高分辨率的組織細胞斷層掃描[2]。并且由于激光掃描共聚焦顯微鏡采用數(shù)字化成像，因而輔以一定的軟件就能對圖像進行定量分析及三維重建等操作。過去對細胞凋亡的形態(tài)學研究方法局限于活性細胞和組織切片染色、熒光鏡觀察，或者石蠟切片原位末端標記法。由于普通光鏡的分辨率和清晰度有限，而電鏡又顯然不適合對凋亡這一復雜動態(tài)過程的監(jiān)測，激光掃描共聚焦顯微鏡的應用使人們對細胞凋亡的形態(tài)學觀察分析提高到了一個前所未有的新水平。
細胞核
核膜的破壞對于染色質聚集并形成凋亡小體起重要作用。lamin是構成核片層的蛋白質，位于核膜的內表面，由caspase-6介導的lamin裂解可影響核膜的完整性[3]。在McCall等[4]的研究中，對果蠅卵子發(fā)生晚期的細胞凋亡現(xiàn)象進行了動態(tài)觀察。以單抗mAb101標記其哺育細胞核內膜的lamin
Dm0（哺乳類lamin B的同源體），用激光掃描共聚焦顯微鏡加以觀察。正常哺育細胞到11期（stage
11）時，染色的lamin呈彌散的霧狀分布并圍繞核周，而dcp-1
GLC哺育細胞即使到了較晚的14期時，仍然顯示界線明確的染色�？梢奷cp-1突變體在核lamin蛋白的酶切或解聚方面存在缺陷。
細胞器
Li 等[5]在對C(6)-�；拾贝颊T導胞內囊泡產(chǎn)生的研究中，在不產(chǎn)生中毒效應的情況下，加入10microM C(6)-酰基鞘氨醇以誘導鼠纖維母細胞
(3T3-L1和3T3-F442A)
凋亡。觀察到囊泡的形成與C(6)-�；拾贝嫉恼T導呈時間依從和劑量依從關系。大量小泡在其加入后8小時內出現(xiàn)，并且隨時間而增大；大泡最終分布在核周，而小泡分布在細胞邊緣。用抗-溶酶體膜蛋白抗體和共聚焦免疫熒光顯微分析，證明增大的囊泡為晚期內吞體/溶酶體。另外，胞內的細胞器都有其適用的熒光探針，如高爾基復合體常用的探針有NBD
ceramide、BODIPY ceramide等，內質網(wǎng)常用的有Dil、DiOC6等[6]，經(jīng)標記均可進行精細的觀察。
當然，激光掃描共聚焦顯微鏡在形態(tài)學中的優(yōu)勢更在于其對圖像的三維重建功能，從而揭示過去只能在平面上顯現(xiàn)的凋亡細胞在三維空間中的結構；而對細胞凋亡的動態(tài)過程，它可以用三維加時間的四維方式進行觀察，來獲取最逼真的形態(tài)學資料。凋亡過程中一些特征性的三維形態(tài)變化正期待著進一步具體的工作去發(fā)現(xiàn)。
激光掃描共聚焦顯微鏡對凋亡細胞的分子水平監(jiān)測
隨著分子生物學突飛猛進的發(fā)展，關于細胞凋亡分子機制的研究已有了很大的突破。細胞凋亡的信號傳遞途徑及其調控涉及到大量的酶級聯(lián)反應、生物大分子的空間轉移等。而激光掃描共聚焦顯微鏡以其定性、定量、定時的優(yōu)點，結合眾多熒光探針的應用，成為了研究細胞凋亡分子水平變化的有力手段。
DNA
大分子DNA斷裂以及染色質的異常凝聚，是細胞凋亡的關鍵[7]，同時也是細胞核在細胞凋亡中具有標志性的變化。Columbara等[8]報道將激光掃描共聚焦顯微鏡與原位TdT和Pol
I免疫熒光技術相結合，進而確定雙鏈和單鏈DNA的斷裂點。而在對細胞凋亡和細胞壞死區(qū)別的研究中[9]，Kressel等在培養(yǎng)的K562細胞中加入放線菌素D以誘導凋亡，并對細胞的DNA片段進行了3’-末端標記。經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)K562細胞凋亡早期有大量DNA片段出現(xiàn)，且DNA片段彌散分布于除核仁外的細胞核區(qū)。伴隨著凋亡的進展，細胞核內出現(xiàn)大量高標記密度的圓形小體。而采用NaN3或快速凍融法使細胞壞死，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察證實，在壞死開始階段并無DNA片段的出現(xiàn)，至少在壞死發(fā)生24小時后才有DNA片段產(chǎn)生。
Caspase家族
Caspases是一組高度保守的半胱氨酸蛋白酶，目前發(fā)現(xiàn)有11個成員。多數(shù)細胞凋亡是以Caspase家族蛋白的激活并作用于其關鍵底物而實現(xiàn)的，而caspases激活的關鍵又在于該家族蛋白間的級聯(lián)反應[10]，因此caspases被認為是細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者，成為研究的熱點。
Mandal等[11]用激光掃描共聚焦顯微鏡對細胞凋亡中激活的caspase-3的重分布進行了研究。用丁酸處理細胞后，觀察到DNA-PKcs的裂解與caspase-3的激活成正相關，而Bcl-2的過度表達則可抑制上述兩個過程。同時還證明（1）激活后的caspase-3重分布到核區(qū)，（2）裂解局部的DNA-PKcs和PARP（polyADP-ribose
polymerase，聚腺苷二磷酸核糖多聚酶），（3）裂解產(chǎn)物又被釋放到核外的細胞液。caspase-3的抑制物四肽DEVD-CHO又可抑制上述的三個連續(xù)的步驟。該研究提示：激活的caspase-3在核內的重分布構成了丁酸所誘導的細胞凋亡中的一個重要凋亡信號。
（生物秀儀器頻道 ）
另外，在用激光掃描共聚焦顯微鏡對Q79誘導大鼠神經(jīng)元凋亡的研究[12]中，Sanchez等發(fā)現(xiàn)了Q79對caspase-8的聚集和激活，而對caspase-8的抑制則阻止了被誘導的細胞凋亡；加以Western
blot分析，還建立了caspase-8的激活和某些神經(jīng)退行性疾�。ㄈ缥璧覆。┑穆�(lián)系。
Grazyme
絲氨酸蛋白酶grazyme為另一種重要的凋亡信號分子，對某些caspase家族蛋白也有激活作用。Trapani等[13]就證明了殺傷淋巴細胞利用穿孔素和grazyme
B的協(xié)同作用來誘導靶細胞的凋亡，在其研究中通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到（1）50%細胞的胞核內快速聚集了以FITC熒光標記的grazyme
B（最長7分鐘，t1/2為2分鐘），然后發(fā)生凋亡；（2）其它的細胞只有細胞液內有FITC-grazyme
B的攝取，避免了凋亡。此間至少在13分鐘后才有DNA碎片的出現(xiàn)，說明核內的grazyme B聚集出現(xiàn)在凋亡的執(zhí)行階段之前。并且通過對核內液的處理（加入70KDa
FITC-dextran），間接觀察到grazyme B的轉移并非是因為核膜受caspases的作用而破損，而是由于穿孔素的協(xié)同。
其它
以上的介紹顯示，激光掃描共聚焦顯微鏡在檢測活細胞酶活性動態(tài)變化方面有著突出的優(yōu)勢。實際上，對于細胞凋亡的分子機制這樣一個極其復雜的課題，激光掃描共聚焦顯微鏡的應用遠不只限于上述的幾種離子和大分子，而是滲透到了大量的分枝課題中去。如在對重要的凋亡負調控蛋白Bcl-2的研究中，Beham等[14]利用基因毒性損害（genotoxic
damage）誘導細胞凋亡，并以Bcl-2蛋白抑制其凋亡過程。用激光掃描共聚焦顯微鏡和Immunoblotting觀察顯示，Bcl-2的作用在于阻止了誘導產(chǎn)生的p53蛋白向核內的轉運。而Ohsawa等[15]對獨立于caspase家族的另一種重要蛋白酶—組織蛋白酶進行了研究，用血清剝奪法誘導PC12細胞凋亡，并用激光掃描共聚焦顯微鏡監(jiān)測了其精細超微結構改變過程和細胞內組織蛋白酶B和D的免疫活度的對比變化。又如，在人胰島淀粉樣多肽（hIAPP）的研究中，Hiddinga等[16]用表達hIAPP的質粒轉染COS-1細胞誘導凋亡，輔以免疫組化染色，用激光掃描共聚焦顯微鏡證明了hIAPP在細胞的內質網(wǎng)和高爾基復合體內呈簇狀沉積，并與細胞凋亡成相關關系�？傊�，隨著在凋亡中扮演重要角色的生物大分子的不斷發(fā)現(xiàn)，激光掃描共聚焦顯微鏡的應用還會更為寬廣，成為監(jiān)測生物大分子在時間、空間上動態(tài)分布的重要工具。
激光掃描共聚焦顯微鏡與凋亡中的重要生理過程研究
游離鈣分析
Ca2+在多條信號傳遞通路中發(fā)揮著重要的作用，在細胞凋亡中也不例外。用激光掃描共聚焦顯微鏡輔以鈣熒光探針活體測量[Ca2+]較之傳統(tǒng)方法具有無可比擬的優(yōu)點，如熒光探針易于導入，空間分辨率高，反應速度快，多離子同時測定等[17]。
在對大鼠胸腺細胞凋亡的研究中[18]，采用毒胡蘿卜素誘導細胞凋亡，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡對胞內游離Ca2+信號對胸腺細胞凋亡激活作用的研究發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)細胞凋亡所需毒胡蘿卜素的最低濃度為1µM，而此誘發(fā)過程可被Ca2+螯合劑所阻斷，同時還發(fā)現(xiàn)凋亡核的形成和廣泛的DNA斷裂現(xiàn)象，結果表明毒胡蘿卜素誘導的Ca2+增加信號足以激活胸腺細胞的凋亡。另外，F(xiàn)ang等[19]對高效抗癌化療藥物Harringtonine(HT）快速誘導HL-60細胞凋亡的現(xiàn)象進行研究，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察證實了該凋亡過程中的兩個連續(xù)過程，即Ca2+離子在細胞核內的積聚及其進一步的核內區(qū)域化。
線粒體膜電位測定
激光掃描共聚焦顯微鏡可輔以電位敏感性熒光染料進行間接的膜電位測量。通過測量生物膜兩側的熒光強度，代入Nernst方程即可算得該膜兩側的電位差。因為激光掃描共聚焦顯微鏡能有效地排除非焦平面的熒光，因而較之普通熒光顯微鏡能獲得更為準確的膜內外熒光值，避免了可能產(chǎn)生的嚴重誤差。正是激光掃描共聚焦顯微鏡的這一功能，被應用于細胞凋亡中一熱點問題的探討，即線粒體膜電位改變（MPT）、細胞色素C的釋放與細胞凋亡的關系。
在Heiskanen等人的研究中[20]，應用了四甲基羅丹明甲酯（TMRM）來監(jiān)測線粒體的膜電位。在其實驗中，用staurosporine誘導單個PC-6活細胞的凋亡，同時用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察了細胞色素C的釋放與MPT之間的時間關系。結果在用staurosporine后的2小時到7小時，線粒體膜電位發(fā)生了急劇的下降；并用綠熒光蛋白標記細胞色素C，發(fā)現(xiàn)線粒體膜去極化伴隨細胞色素C的釋放。進而，細胞色素C參加到caspase家族蛋白的激活過程中，使細胞最終走向死亡。另外，Minamikawa等[21]也對線粒體在細胞凋亡中扮演的角色進行了研究，在該實驗中，Mitotracker
Red被用以標記線粒體，它具有極強的光敏化作用和潛在的光毒性。當向胞內加入100nM
該熒光探針后，用激光掃描共聚焦顯微鏡成像，常規(guī)掃描所用的激光束在此時通過Mitotracker
Red產(chǎn)生光毒性誘導線粒體的損傷，同時可見線粒體去極化指示劑羅丹明-123的熒光強度迅速下降，說明線粒體發(fā)生了快速去極化，而殘余的少量Mitotracker
Red則使線粒體在損傷后15分鐘內的球狀腫脹得以顯現(xiàn)；對細胞色素C的免疫組化染色也顯示在上述光照后細胞色素C由線粒體彌散到胞漿中的現(xiàn)象。
結語
在當今生物醫(yī)學的研究中，從分析走向綜合、從靜態(tài)走向動態(tài)、從現(xiàn)象走向本質是一個大趨勢。在細胞凋亡這個誘人課題的研究中，有復雜的生化級聯(lián)反應，有精細交織的信號傳導途徑，有生物膜電位的改變以及最終形態(tài)上的大體變化，激光掃描共聚焦顯微鏡作為一種全新的實驗手段，輔以眾多熒光探針的創(chuàng)造性運用，的確顯示出了強大的生命力。
同時，應該認識到只有選擇合適的熒光探針，才能保證實驗的順利進行并獲得理想的結果。因此，選擇熒光探針時須考慮到：（1）現(xiàn)有儀器所采用的激光器，（2）熒光探針的光穩(wěn)定性和光漂白性，（3）熒光的定性或定量，（4）熒光探針的特異性和毒性，（5）熒光探針適用的PH值[22]。另外，激光掃描共聚焦顯微鏡的有效應用尚需與其它技術聯(lián)合互補，如對膜電位的定量研究中，可用微電極進行膜片鉗記錄或胞內記錄，在測量膜電位同時測量熒光信號，以求出標準曲線[17]。
總而言之，從激光掃描共聚焦顯微鏡在細胞凋亡研究中應用可以展望，這項多功能、高精度、自動化的實驗手段必會在將來的科學研究中發(fā)揮更加重要的作用。
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作者：劉暢等 來源：華西醫(yī)科大學附一院
劉暢 顧玲 綜述 步宏 審校
（華西醫(yī)科大學附一院 移植免疫實驗室，610044）
標簽：
激光掃描共聚焦顯微鏡 凋亡
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