光學(xué)顯微鏡的原理與構(gòu)造
瀏覽次數(shù):6075 發(fā)布日期:2008-4-23
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隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,顯微鏡檢方法由最傳統(tǒng)的明視野、暗視野發(fā)展出了相差法、偏光方法;熒光方法也由透射光激發(fā)進(jìn)展為落射光激發(fā),使熒光效率大為提高;微分干涉相襯方法基于偏光方法,而巧妙地利用了微分干涉棱鏡,使之能應(yīng)用于醫(yī)學(xué)與生物學(xué)的樣品,又能應(yīng)用于金相樣品的分析與檢驗(yàn)。
下面簡(jiǎn)單介紹萬(wàn)能顯微鏡的基本組成部件:
1. 顯微鏡主機(jī)體(stand) 顯微鏡的主機(jī)體設(shè)計(jì)成金字塔形,而底座的截面呈T字形,使顯微鏡的整體相當(dāng)穩(wěn)固。顯微鏡的光學(xué)部件和機(jī)構(gòu)調(diào)節(jié)部件、光源的燈室、顯微照相裝置、電源變壓穩(wěn)壓器等,都可安裝在主機(jī)體上或主機(jī)體內(nèi)。
2. 顯微鏡的底座(base) 底座和主機(jī)體通常組成一個(gè)穩(wěn)固的整體。底座內(nèi)通常裝有透射光照明光路系統(tǒng)(聚光、集光和反光)部件,光源的濾光片組,粗/微調(diào)焦機(jī)構(gòu),光源的視場(chǎng)光闌也安裝在底座上。
3. 透射光光源(tranilluminator) 透射光光源由燈室(lamp housing)、燈座(lamp socket)鹵素?zé)簦╤alogen lamp)、集光與聚光系統(tǒng)(lamp collector and lamp condenser)及其調(diào)整裝置組成。
4. 透射光光源與反射光光源的轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)(toggle switch) 這是新一代AXIO系列顯微鏡特有的裝置,透射光和反射光可通用。當(dāng)具有透/反兩用的配置時(shí),利用這一轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)能方便而又迅速的使透射光和反射光互相轉(zhuǎn)換。在純透射光的配置中,這一開(kāi)關(guān)就改為電源開(kāi)關(guān)。
5. 電源開(kāi)關(guān)(mains switch)與亮度調(diào)節(jié)旋鈕(brightness control) 電源開(kāi)關(guān)用來(lái)接通或切斷顯微鏡所需用的交流電源。電源開(kāi)關(guān)旋鈕也可調(diào)節(jié)照明光源的亮度,使所觀察的視域可隨時(shí)獲得適當(dāng)?shù)牧炼龋烧{(diào)范圍為3-12V。作顯微照相時(shí),可根據(jù)曝光以及彩色底片色溫的要求來(lái)調(diào)節(jié)燈光的亮度。當(dāng)準(zhǔn)備關(guān)掉電源之前,應(yīng)先將亮度調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)到最小。
6. 粗、微調(diào)焦旋鈕(coaxial coarse/fine focusing controls) 調(diào)焦旋鈕轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)帶動(dòng)燕尾導(dǎo)板上下移動(dòng),而導(dǎo)板上則裝有物臺(tái)托架和聚光鏡托架,從而使物臺(tái)趨向或遠(yuǎn)離物鏡達(dá)到調(diào)焦的效果。
7. 透射光用的濾光片選擇按鈕(push buttons for filter magazine) 透射光顯微鏡檢方法所需用的一組濾光片已安裝在顯微鏡的底座內(nèi),通過(guò)底座外的按鈕就可以根據(jù)不同的需要來(lái)選擇適用的一塊或一組濾光片。通常的濾光片配套有: (1) 藍(lán)色色溫轉(zhuǎn)換濾光片:用來(lái)把光源的色溫由3200K轉(zhuǎn)換成日光型彩色底片所需的5500K色溫; (2) 綠色濾光片:用來(lái)增強(qiáng)相差觀察方法中成像的反差,或者以黑白底片作顯微照相時(shí),可以提高片成像的反差; (3) 淺灰色濾光片:是透光率為50%的中性減光濾光片,可把視野的亮度減弱一半; (4) 灰色濾光片:是透光率為25%的中性減光濾光片,可把視野的高度減弱75%; (5) 透光率僅為6%的中性減光濾光片,可把視野的亮度變得相當(dāng)暗,95%以上的光都已被吸收掉。
8. 光源的視場(chǎng)光闌(luminuos field diaphragm) 視場(chǎng)光闌是顯微鏡照明光路系統(tǒng)中的重要部件之一,它只能按照庫(kù)勒照明系統(tǒng)的要求來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié),視場(chǎng)光闌不可以任意開(kāi)大,但要根據(jù)使用的物鏡倍數(shù)來(lái)調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)拇笮。視?chǎng)光闌的主要功用有:
(1) 控制雜散光在成像光路系統(tǒng)中的影響,特別是免除雜散光對(duì)照相系統(tǒng)的干擾,使顯微照相的底片不至于蒙上一層灰霧;
(2) 控制照明光束的大小,使所觀察的視域能受到均勻的照明;
(3) 在熒光顯微鏡檢方法中,可以把激發(fā)光限制在所需激發(fā)樣品的視域范圍內(nèi),以防止視域外的樣品過(guò)早受到激發(fā)。
9. 聚光鏡系統(tǒng)(condenser system) 聚光鏡系統(tǒng)是照明光路系統(tǒng)中的重要部件之一,它也只能按照庫(kù)勒照明系統(tǒng)的調(diào)整要求來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。聚光鏡系統(tǒng)調(diào)整的好壞,可以直接影響顯微鏡視域中照明的均勻性,也可影響顯微鏡的分辨力,還可以直接控制顯微照相底片上的反差。聚光鏡系統(tǒng)通常由以下幾個(gè)部件組成:
(1) 聚光鏡本體(condenser) 可以是簡(jiǎn)單的阿貝聚光鏡,也可以是消球差-消色差的優(yōu)質(zhì)聚光鏡,另外還有一種是消除了內(nèi)應(yīng)力的偏光聚光鏡。聚光鏡的重要參數(shù)之一是數(shù)值孔徑(NA),通常為0.32;這樣的數(shù)值孔徑太小,只能與以下的物鏡配合使用,因此需配用前端透鏡來(lái)提高數(shù)值孔徑,以便與不同倍數(shù)的物鏡靈活配合使用;
(2) 前端透鏡(front lens) 前端透鏡本身的數(shù)值孔徑通常為0.63、0.90、1.30或1.40,它要附裝在聚光鏡本體上,可以方便地?cái)[進(jìn)或擺出光路。最常用的前端透鏡數(shù)值孔徑為0.90,當(dāng)它擺入光路時(shí),可以和10×及以上的物鏡配用,擺出光路時(shí)可以和10×以下的物鏡如6.3×、5×及2.5×等物鏡配用;
(3) 聚光鏡的孔徑光闌(aperture diaphragm) 孔徑光闌實(shí)際上是一個(gè)可變光圈,它是顯微鏡照明光路系統(tǒng)中的又一個(gè)重要部件,在透射光明視野法、微分干涉相襯法以及偏光法所使用的聚光鏡中,都裝有孔徑光闌。它可以影響顯微鏡在作觀察時(shí)的分辨力;直接控制顯微照相底片上的反差;可用來(lái)調(diào)節(jié)聚光鏡的數(shù)值孔徑,配合所用物鏡的數(shù)值孔徑,以取得最佳的分辨本領(lǐng),或最大的分辨本領(lǐng);還可以使光源的發(fā)光體成像于孔徑光闌所在的平面上,從而滿足庫(kù)勒照明系統(tǒng)的前提條件。在實(shí)際操作中,調(diào)節(jié)聚光鏡孔徑光闌可以改變顯微鏡中所觀察到的視野亮度,這是由于歷史上對(duì)聚光鏡孔徑光闌的誤解所造成的錯(cuò)誤用法。這里要特別強(qiáng)調(diào):不應(yīng)該用聚光鏡的孔徑光闌來(lái)調(diào)節(jié)視野中的亮度、更不應(yīng)該用調(diào)節(jié)聚光鏡位置高低的方法來(lái)調(diào)節(jié)視野中的亮度!以往的錯(cuò)誤用法希望能在實(shí)際操作中糾正過(guò)來(lái)。
(4) 轉(zhuǎn)盤(pán)(turret) 在多用途聚光鏡系統(tǒng)中,為方便才把明視野的孔徑光闌、暗視野的中央光擋、相差法所需用的各種不同直徑的環(huán)狀光圈、微分干涉相襯法用的DIC棱鏡及其孔經(jīng)光闌等部件裝在轉(zhuǎn)盤(pán)上再嵌入到聚光鏡本體的座子內(nèi),使用時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)盤(pán)就可以選用不同顯微鏡檢法所適用的聚光鏡,方便而又快捷。
聚光鏡系統(tǒng)有兩個(gè)調(diào)節(jié)裝置:a. 聚光鏡的調(diào)中螺絲(centering screws) 調(diào)中螺絲通常為1對(duì),位于聚光鏡托架前方的左右測(cè)。和環(huán)形燕尾槽中的調(diào)中螺絲成三足鼎立之勢(shì),可以聚光鏡前后、左右調(diào)整,使聚光鏡的光軸與照明光路、成像光路合軸;b. 聚光鏡托架的上下調(diào)節(jié)裝置(vertical adjustment of condenser carrier): 利用這個(gè)調(diào)節(jié)裝置,可使聚光鏡的位置作上下調(diào)動(dòng),使視場(chǎng)光闌經(jīng)過(guò)聚光鏡在樣品視野中的成像調(diào)到最為清晰,光闌像的位置也可利用托架上的調(diào)中螺絲來(lái)進(jìn)行調(diào)中,從而滿足庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整的要求。
10. 機(jī)械移動(dòng)式載物臺(tái)(specimen stage) 載物臺(tái)可以承載樣品,裝有可在水平方向上作前后、左右移動(dòng)的調(diào)節(jié)裝置,有的還可以在水平方向上作大約100度的旋轉(zhuǎn),以便使樣品能更好地與顯微照相的取景框相適配。
11. 物鏡轉(zhuǎn)換器(nosepiece) 物鏡轉(zhuǎn)換器安裝在滑插式燕尾槽座上,已作了準(zhǔn)確的對(duì)中?裳杆俑鼡Q物鏡。常用的有6個(gè)、5個(gè)及4個(gè)孔位的物鏡轉(zhuǎn)換器。
12. 物鏡(objectives) 物鏡是顯微鏡的核心光學(xué)部件,顯微鏡的放大倍數(shù)、分辨本領(lǐng)、色差與像差的校正狀況、工作距離等,都有直接由物鏡來(lái)決定。衡量物鏡質(zhì)量的基本參數(shù)主要有:a. 色差消正的程度(或級(jí)別);b. 像場(chǎng)平坦的程度;c. 所使用的玻璃材料。數(shù)值孔徑(NA)是物鏡最重要的參數(shù),數(shù)值孔徑越大,分辨率越高。目前物鏡的數(shù)值孔徑最大只有1.30。按照物鏡色差和像差校正的程度,物鏡可以分為以下類別:
(1) 消色差物鏡(achomats) 通常對(duì)紅光與藍(lán)光兩種色光作了色差校正,但視域中像場(chǎng)的平坦程度并未作過(guò)完善的校正,因此只能作一般的觀察應(yīng)用。在偏光顯微鏡中,由于需要消除物鏡內(nèi)各個(gè)鏡片的內(nèi)應(yīng)力,反而需要利用這種鏡片數(shù)目不多的物鏡來(lái)做偏光物鏡。
(2) 有限平像場(chǎng)消色差物鏡(flat-field achromats) 這也是對(duì)兩種色光作了校正的消色差物鏡,但視域范圍內(nèi)像場(chǎng)的平坦程度只作了有限范圍內(nèi)的校正,通常在顯微照相取景框范圍內(nèi)像場(chǎng)是平坦的,以確保顯微照相對(duì)焦的清晰,取景框范圍以外,往往不一定能保證同樣的清晰度。適用于常規(guī)檢驗(yàn)而又需要作顯微照相的工作中。
(3) 完善平像場(chǎng)消色差物鏡(plan-achromats) 這也是對(duì)兩種色光作了校正的高級(jí)消色差物鏡,主要特點(diǎn)是像場(chǎng)在整個(gè)視域中作了完善的校正,適合于作要求較高的顯微鏡檢工作,特別是作顯微照相效果更好。由于這種物鏡仍采用常用的光學(xué)玻璃,不適宜作熒光等這一類弱光的觀察和照相。
(4) 螢石玻璃消色差物鏡(neofluar) 這也是對(duì)兩種色光作了色差校正的消色差物鏡,其中全部或部分鏡片則采用了可透過(guò)近紫外光(波長(zhǎng)約為365nm)的螢石玻璃(即氟化鈣晶體)來(lái)制造。因此特別適合于作熒光與相差方法的觀察與顯微照相,也可用在偏光顯微鏡中。
(5) 完善平像場(chǎng)復(fù)消色差物鏡(plan-opo-chromats) 這是最高一級(jí)的消色差物鏡,對(duì)紅、綠、藍(lán)3種顏色都作了很好的色差校正,而視域中的像也作了完善的校正,數(shù)值孔徑比螢石物鏡大,可應(yīng)用于要求極高的顯微觀察與顯微照相中,但價(jià)格十分昂貴,由于所使用的鏡片數(shù)目多達(dá)12片,光能損失較大,不宜用作熒光觀察與照相。
(6) 已消除內(nèi)應(yīng)力又可以調(diào)節(jié)中心的物鏡(pol Z objectives) 這是一種適用于作偏光觀察的物鏡,是從以上所介紹的幾種物鏡中挑選出來(lái)的,在裝配時(shí)特別注意消除了其中的內(nèi)應(yīng)力,以免內(nèi)應(yīng)力所引起的干涉條紋干擾了偏光樣品中真正的干涉條紋。
(7) 完善平像場(chǎng)螢石消色差多種介質(zhì)浸沒(méi)式物鏡( plan-neofluar imm.) 這是一種新型物鏡,采用螢石玻璃制造其中全部或部分鏡片,成像質(zhì)量特別明亮,反差十分好,色差接近于復(fù)消色差,因此又屬于半復(fù)消色差物鏡。數(shù)值孔徑特別大,透光能力強(qiáng),而且分辨率十分好。最大的特點(diǎn)是可用好幾種浸沒(méi)介質(zhì),如常用的浸沒(méi)油、甘油、蒸餾水等,既可使用權(quán)蓋玻片也可以不使用。這種物鏡制成干式物鏡時(shí),可加上校正環(huán),用來(lái)校正蓋玻片的厚度不均勻性,以消除蓋玻片厚度不規(guī)則造成的成像失真,對(duì)于厚度在0.12-0.22mm之間的蓋玻片都可以作相應(yīng)的校正。
1986年以來(lái),德國(guó)蔡司公司推出的新一代光學(xué)顯微鏡,其中的物鏡突破了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的概念,采用了無(wú)限遠(yuǎn)色差校正的光學(xué)系統(tǒng)(infinity color-corrected system,簡(jiǎn)稱ICS物鏡),其特點(diǎn)是:由物鏡射出的成像光束是一束平行光,可在成像光路中按需要插入任意多的光學(xué)部件而不影響成像質(zhì)量。在顯微鏡鏡體內(nèi)有一特制的鏡筒透鏡(tube lens)與物鏡相配,兩者結(jié)合起來(lái)把物鏡的色差與像差都作了十分完善的校正,而且物鏡的視域相當(dāng)寬闊,比傳統(tǒng)物鏡的視域擴(kuò)大約40% 。
13. 熒光濾光片組插板的插口(slot for the fluorescence slider)這是為作熒光觀察時(shí)插入熒光濾光片組插板預(yù)留的插口。
14. 勃氏鏡插板的插口(slot for Bertcand-lens slider) 這是為作偏光觀察時(shí)插入勃氏鏡插板預(yù)留的插口,勃氏鏡是偏光顯微鏡中用作錐光干涉圖試驗(yàn)的重要部件。
15. 補(bǔ)色器插板的插口(slot for auxiliary objects) 這是當(dāng)作微分干涉相襯觀察和偏光需加入的各種補(bǔ)色器預(yù)留的插口。
16. 雙目鏡筒或帶照像鏡筒的雙目鏡筒(binocular tubes or binocular phototubes) 用來(lái)安放目鏡及照像裝置。為便于觀察,鏡筒制成具有一定傾斜角度(30°或45°),設(shè)有瞳距調(diào)節(jié)裝置,可在55°至75°范圍內(nèi)調(diào)節(jié),以適合不同使用者兩眼瞳孔距離。雙目鏡筒內(nèi)裝有一些折光和分光棱鏡,能把從物鏡出來(lái)的一束成像光束等分成兩部分,分別由兩個(gè)目鏡作觀察。帶照像鏡筒的雙目筒一般在右測(cè)裝有光束分配棱鏡的拉桿,把它全部推入時(shí)只作觀察,拉出來(lái)則一邊觀察一邊照像,或全部作顯微照像。
17. 目鏡(eyepieces) 目鏡是顯微鏡中把物鏡所成的像作再一次放大的光學(xué)部件,顯微鏡的總放大倍數(shù)通常就是物鏡與目鏡放大倍數(shù)的乘積。為方便不同視力者進(jìn)行顯微拍照時(shí)調(diào)焦同樣清晰,一些目鏡設(shè)計(jì)成可調(diào)焦式。為了使顯微鏡獲得最大有效放大倍數(shù)和最高分辨本領(lǐng),必須合理選配目鏡。到目前為止,由于受光學(xué)定律的制約,光學(xué)顯微鏡最大的有效放大倍數(shù)為1250-1300倍。10×目鏡是最常用而必須配備的目鏡,觀察熒光時(shí)最好選用10×以下的目鏡。