摘 要：當今生物學領域的研究一個熱點之一是細胞凋亡。開展對細胞凋亡的研究，首先要解決是方法學問題。作者從凋亡細胞的特征性核DNA片段檢測著手，闡述了多種凋亡細胞核DNA片段檢測方法以及近年來的一些新進展。

細胞凋亡（apoptosis）又稱細胞凋謝或稱程序性細胞死亡（Programmed cell death，PCD），是有別于細胞壞死而受基因控制的一種主動性細胞自殺過程。對細胞凋亡的研究已成為當今生物學領域的熱點之一。開展對細胞凋亡的研究，首先要解決的是方法學問題。根據(jù)凋亡細胞的生化特征檢測組織或培養(yǎng)細胞中的細胞凋亡發(fā)生狀況，是一種特異而敏感的方法，特別是與其他方法（如流式細胞儀）結合后，可以對細胞凋亡進行定性和定量的研究。下面根據(jù)生化特征檢測細胞凋亡的方法學及有關進展作一綜述。

1 瓊脂糖凝膠電泳
細胞凋亡最顯著而具特征性的生化特征是DNA降解為大約由180～200 bp或其多聚體組成的寡核苷酸片段，瓊脂糖凝膠電泳可見特征性的“梯狀（Ladder）”帶。有些類型的細胞發(fā)生凋亡時DNA并不降解成寡核小體片段[1]，有證據(jù)表明[1,2]：凋亡細胞的DNA降解，早先可產(chǎn)生一些DNA大片段，可以是30～50、200～300、700 kb或更大，隨后再降解成180～200 bp的寡核小體片段或不出現(xiàn)這一步[3]。根據(jù)上述細胞凋亡的生化特點，列舉幾種常見的瓊脂糖凝膠電泳方法。

1.1 常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳

1.1.1 經(jīng)典的瓊脂糖凝膠電泳[3] 該方法主要用蛋白酶K消化和酚、氯仿，異戊醇抽提去蛋白，無水乙醇和乙酸鈉沉淀DNA，然后行瓊脂糖凝膠電泳。該方法提取的DNA純度高。缺點是過程較復雜，所需時間較長，小片段DNA易丟失，且實驗人員需與酚、氯仿等有毒物質接觸。
1.1.2 簡易的DNA提取方法[4,5] 有許多種提取凋亡細胞核DNA的方法，如乙醇固定、磷酸-枸櫞酸（PC）緩沖液提取法，TritonX-100低滲處理細胞DNA小片段提取法等。這些方法的特點是方法簡便、快速；選擇性提取小片段DNA，因而敏感性較高；無需與酚、氯仿等毒性試劑接觸。

1.2 [6]反轉電場凝膠電泳（Field inversion gel elec-trophoresis，F(xiàn)IGE）由于細胞凋亡的某一階段可產(chǎn)生大片段DNA，用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳是檢測不出來的，這時得用FIGE技術，F(xiàn)IGE對只產(chǎn)生大片段DNA而沒有寡核小體片段產(chǎn)生的細胞凋亡特別有用，結合形態(tài)學改變，可檢測較早期的細胞凋亡。

1.3 彗星鑒定（Comet assay）[7] 彗星鑒定又稱單細胞凝膠電泳鑒定（Single cell gel assay）或微凝膠電泳（Microgel electrophoresis）。由于電泳的結果很象彗星，故名“彗星鑒定”。主要用于檢測少量單個細胞（Individual cells）DNA損傷的程度。主要分為兩大類：中性彗星鑒定和堿性彗星鑒定，分別檢測雙鏈和單鏈DNA片段。彗星的形成是因為有損傷的DNA在電泳中從細胞核中釋放出來發(fā)生遷移，有多種方法估計和定量彗星形成的類型。一種常用而準確的方法是分析一種稱之為tail moment的終點（endpoint）現(xiàn)象，包括了尾長（Tail length）和尾部中總DNA的部分。分析tail moment可同時得知最小的發(fā)生了遷移的DNA（反映在彗星尾的長度）和被釋放或斷裂的DNA片段（通過尾部DNA的熒光強度反映出來）。
彗星鑒定可用于檢測凋亡細胞寡核小體片段，在中性和堿性彗星鑒定中其終點現(xiàn)象都很明顯。在標準的堿性彗星鑒定中，凋亡細胞DNA片段遷移的長度是沒受損傷細胞的幾倍。彗星鑒定檢測DNA斷鏈極為敏感，有人認為比流式細胞儀方法還能更早地檢測出凋亡細胞。特別適用于少數(shù)甚至單個細胞的檢測。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳的定量檢測常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測凋亡細胞中的寡核小體片段的缺點是敏感性不高，且不能定量。有學者[8]在常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳的基礎上，將放射性同位素P32標記寡核小體片段的5’末端，在X光片上放射自顯影成像，并用特定的設備分析計算進行定量研究。該方法的優(yōu)點是靈敏度極高，是常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳的1000～2000倍，能檢測出極微量的寡核小體片段（pg級），且能進行定量。但因需與放射性同位素接觸，又需要一定的專門設備，從而其應用受到限制。

2 原位末端標記（in situ end-labeling，ISEL）技術
原位末端標記是將摻入到凋亡細胞中的外源性核苷酸在某種酶的催化下與凋亡細胞中的單股或雙股斷鏈相結合，并通過一定的顯示系統(tǒng)使之顯示出來。通常有兩種方法，一是末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記，簡稱TUNEL鑒定；二是DNA聚合酶I或Klenow大片段介導的原位缺口翻譯，簡稱ISNT鑒定。在不考慮所使用的酶時，統(tǒng)稱為原位末端標記（in situ end-labeling，ISEL）[9,10]。這兩種方法用于檢測組織或培養(yǎng)細胞中凋亡細胞的核斷裂片段，可以檢測早期的細胞凋亡[10]，且特異性和敏感性都是較高的。特別是近年來，通過在方法學上的不斷改進，其敏感性有了很大的提高。就其敏感性而言，TUNEL鑒定高于ISNT鑒定[10,11]。根據(jù)標記在dUTP上的標記物和顯示系統(tǒng)的不同，可分別作組織切片凋亡細胞和培養(yǎng)細胞涂片的原位檢測及培養(yǎng)細胞的流式細胞儀檢測。

2.1 ISNT（in situ nick translation）[12,13，14,15] ISNT鑒定的基本原理是基于細胞凋亡時產(chǎn)生DNA斷鏈，斷鏈有一粘性末端，一條含有游離的3''羥基末端，另一條有伸出的5''末端。利用Klenow大片段的5''-3''聚合酶活性，可將外源摻入的生物素-dUTP從3''羥基末端起始經(jīng)5''-3''方向連接在斷端上，通過帶有辣根過氧化物酶的卵白素（avidin）與之結合，經(jīng)DAB顯色，便可觀察到細胞是否存在有核苷酸摻入的DNA斷端。該方法主要用于組織切片的原位檢測，也可用于細胞涂片的檢測。對組織切片進行預處理是必要的，可以提高該方法的敏感性和消除假陽性及非特異性染色

2.2 TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling，） TUNEL鑒定的原理與ISNT鑒定相似，所需試劑也與ISNT鑒定相似，不同的是介導的酶是TdT，無需dATP、dCTP、dGTP。用于組織切片和培養(yǎng)細胞的檢測，其敏感性較ISNT要高。近年來，該方法經(jīng)過眾多的學者的改進，其特異性特別是敏感性方面有很大的提高。就提高敏感性而言，組織切片和細胞的預處理是很重要的。Negoescu等[9]比較了幾種固定劑（包括甲醛、多聚甲醛、丙酮、B5、Bouin’s固定液和甲醇）和預處理方法（包括去垢劑、蛋白酶和微波爐處理）對敏感性的影響，結果顯示：在沒有作預處理時，TUNEL鑒定的敏感性很差，只有3%～17%的具有凋亡細胞形態(tài)學特征的細胞被標記上；在使用了預處理方法后，無論何種固定劑，其敏感性都有所提高。比較了去垢劑（如Triton）、蛋白酶、蛋白酶結合微波爐和單獨微波爐預處理組織和細胞，以單獨微波爐處理的效果最好。可將敏感性提高4～30倍，特異性沒有多大的改變。

2.3 凋亡細胞的TUNEL和ISNT鑒定的流式細胞儀分析[16]對于培養(yǎng)的細胞，可以將TUNEL或ISNT鑒定同流式細胞儀結合起來分析其發(fā)生凋亡的情況。待檢細胞與含有TdT或DNA聚合酶I或Klenow片段及生物素標記的dUTP反應液共孵育一段時間后，加入熒光素（常用FITC）標記的鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin），使之特異性地與掛在DNA斷鏈上的生物素結合，然后在流式細胞儀上分析熒光強度，可結合其他的熒光染色方法（如PI染色和熒光免疫表型鑒定）行多參數(shù)的流式細胞儀分析，使之有很廣的應用價值。該方法的主要優(yōu)點有：可根據(jù)熒光強度對凋亡細胞作出定量分析；可以區(qū)別凋亡和壞死；結合表型鑒定，確定不同來源的細胞群中某一或幾種細胞亞群的凋亡；其檢測與凋亡相關的DNA降解片段的特異性和敏感性比瓊脂糖凝膠電泳高得多，能檢測出少于（2～5）×103個細胞的DNA斷鏈。

3 細胞凋亡的ELISA檢測[17]
細胞凋亡ELISA檢測就是基于酶聯(lián)免疫吸附夾心法測定原理，用單克隆抗DNA抗體和抗組蛋白抗體直接檢測DNA和組蛋白，可特異性定量檢測細胞溶解物細胞漿成分中的單和寡核苷酸小體。其優(yōu)點有：無需使用放射性同位素；可對細胞凋亡進行定量檢測；抗組蛋白抗體無物種的特異性，可用于各種物種的細胞凋亡的檢測；高敏感性，較少的細胞就可獲得結果。

4 結語
瓊脂糖凝膠電泳簡單、方便，出現(xiàn)“梯狀”帶雖能證實凋亡，但只能定性不能定量，不是隨時電泳都能得到“梯狀”帶，因而敏感性不高，且這種方法一般只用于培養(yǎng)的細胞，而組織的異源性不能保證該方法的特異性；其他一些電泳方法如反轉電場凝膠電泳和彗星鑒定也有其自身的應用條件，針對性較強。原位末端標記法的出現(xiàn)，是細胞凋亡方法學上的一大進步，特別是經(jīng)眾多學者的應用和完善，其特異性尤其是敏感性方面有了很大的提高，廣泛應用于各種組織、細胞培養(yǎng)的細胞凋亡的研究，特別是結合抗原免疫表型鑒定和流式細胞儀分析，可以區(qū)分不同來源的組織或細胞中的某種或幾種細胞亞群的凋亡，并進行定量研究。正如上面所說，該方法的特異性有一定的限度，就其技術本身而言，并不能區(qū)別凋亡、壞死和自溶性死亡，必須結合凋亡細胞的形態(tài)學特征加以判斷。因此，在細胞凋亡的研究中，多種方法的結合是必要的，也是必須的。

作者簡介：譚曉華,男,1962年出生,博士,主治醫(yī)師作者單位：姜泊　張亞歷　周殿元　(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化內科研究所，廣州，510515)
譚曉華 (北京軍區(qū)總醫(yī)院肝病研究所)

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