隨著計(jì)算機(jī)、光學(xué)顯微鏡、大數(shù)值孔徑復(fù)消色差物鏡、高分辨率分析顯示、激光源、激光功率、高敏感度探測器、聲光轉(zhuǎn)換電子控制和各種熒光標(biāo)記物的發(fā)展，共聚焦顯微鏡向更精、更快、多維和無損傷性分析的方向發(fā)展。技術(shù)進(jìn)步不斷使共聚焦顯微鏡產(chǎn)生革新，我們重點(diǎn)關(guān)注三大共聚焦顯微鏡制造商奧林巴斯（Olympus）、尼康（Nikon）和卡爾蔡司（Carl Zeiss）在這場技術(shù)革命中的所作所為。

共聚焦顯微鏡是隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和光電技術(shù)的飛躍發(fā)展，在80年代后期發(fā)展起來的。它是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上增加了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，使用紫外光或激光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化或生理功能的改變。在醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，共聚焦顯微鏡可進(jìn)行活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察、細(xì)胞無損傷探測、免疫熒光標(biāo)記和離子熒光探針的觀察和研究，等等。

和普通顯微鏡相比，共聚焦顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是有目共睹的，用它可以掃描3-D圖像，并且有更高分辨率，可以產(chǎn)生質(zhì)量更好的圖像，還可以控制掃描的深度。但是，因?yàn)楣簿劢癸@微鏡的高昂價(jià)格，使得很多資金不是十分寬裕的實(shí)驗(yàn)室，對共聚焦顯微鏡只能是望而卻步。隨著技術(shù)的進(jìn)步，共聚焦顯微鏡的操作更加簡單方便，而且價(jià)格也越來越便宜，使越來越多的實(shí)驗(yàn)室能夠買得起，從而為科學(xué)家們提供完善的研究工作站。

技術(shù)進(jìn)步
使共聚焦系統(tǒng)的操作簡化當(dāng)前的科學(xué)研究問題越來越復(fù)雜，共聚焦系統(tǒng)工藝研究人員一直致力于把系統(tǒng)做得更加容易操作。如今，研究人員不斷的要求新功能和多樣性，這對系統(tǒng)的結(jié)實(shí)性和簡便性來說是一個(gè)挑戰(zhàn)。一方面，要滿足客戶對產(chǎn)品質(zhì)量和多功能性提出的更新的要求，使得現(xiàn)在的系統(tǒng)做得越來越強(qiáng)大；另一方面，這樣做加深了系統(tǒng)易操作之間的矛盾。

盡管如此，對于共聚焦系統(tǒng)，容易操作仍然被認(rèn)為是重中之重。儀器使用者感覺到容易操作的是它的用戶界面，用戶界面必須簡單、直觀。例如，在使用尼康軟件的時(shí)候，不需要把所有用到的窗口全打開。控件被隱藏在標(biāo)簽后面，這不但使界面更加簡潔，而且有效的防止了用戶的誤操作，這一點(diǎn)對于新用戶來說尤其重要。又如，卡爾蔡司開發(fā)人員認(rèn)為，在設(shè)計(jì)和執(zhí)行共聚焦圖像系統(tǒng)的時(shí)候，容易使用應(yīng)該作為它的一個(gè)本質(zhì)屬性。

技術(shù)進(jìn)步改善了
共聚焦系統(tǒng)的性能和性價(jià)比共聚焦儀器的性能不斷提高，使用者越來越多，他們都是直接參與科學(xué)研究、具有不同水平的專家，儀器制造商必須能夠滿足這些不同水平專家的需求。用戶都期望性價(jià)比不斷提高，隨著技術(shù)的進(jìn)步，相同性能的系統(tǒng)價(jià)格在不斷下降。但是制造商稱，系統(tǒng)的價(jià)格會(huì)不會(huì)降低是另外一個(gè)問題。像計(jì)算機(jī)工業(yè)一樣，價(jià)格不會(huì)增加，只是價(jià)值在不斷增加。因此，我們沒有看到共聚焦顯微鏡的價(jià)格大幅度變化，但是其功能卻是新增加了不少。其中最主要的是增加了許多新的成像和分析方法，例如多光譜和多光子成像、熒光相關(guān)分光顯微鏡和全程成像，等等�？紤]到社會(huì)發(fā)展使物價(jià)不斷攀升，共聚焦系統(tǒng)略微下降的價(jià)格確實(shí)可以說是價(jià)格在不斷降低，而對科研項(xiàng)目資助的不斷提高，使得越來越多的實(shí)驗(yàn)室能夠買得起共聚焦顯微鏡。

共聚焦顯微鏡

在生命科學(xué)研發(fā)中所占的比重共聚焦顯微技術(shù)幾乎已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)中一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的研究工具。借助其他各種常規(guī)分析，通過成像方法回答了越來越多的科學(xué)問題�，F(xiàn)在的共聚焦顯微鏡的功能非常多，好像是一個(gè)科研工作站，其應(yīng)用也大多在生命科學(xué)研究領(lǐng)域。尼康95％的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)都銷往生物科學(xué)領(lǐng)域。而奧林巴斯顯微鏡在北美的銷售，成像相關(guān)設(shè)備和軟件的市場都集中在生命科學(xué)領(lǐng)域，幾乎所有的共聚焦顯微鏡都供應(yīng)到生命科學(xué)的實(shí)驗(yàn)室和研究中心。應(yīng)用于活細(xì)胞的共聚焦顯微鏡對活細(xì)胞研究是必要的，并且正在成為活細(xì)胞研究的一個(gè)常規(guī)工具。如果一個(gè)多熒光蛋白質(zhì)標(biāo)記的細(xì)胞有很小的時(shí)間間隔的激發(fā)光譜，那么要觀測它們，就需要利用光譜成像來區(qū)分這些不同的激發(fā)光譜，所以尼康引入C1si光譜共聚焦�？�爾蔡司特別關(guān)注熒光顯微技術(shù)，它的顯微對比方法的特異性是其突出的優(yōu)點(diǎn)，并且提出了“卡爾蔡司：熒光科學(xué)”口號。

CCD探頭工藝

對共聚焦系統(tǒng)的影響共聚焦顯微鏡制造商都一致認(rèn)為，CCD探頭工藝的提高會(huì)對未來共聚焦系統(tǒng)產(chǎn)生重大的變革。從過去到現(xiàn)在，CCD的敏感性一直在不斷的提高，而且CCD探頭工藝的進(jìn)一步提高將會(huì)對未來的共聚焦系統(tǒng)產(chǎn)生更重要的影響。CCD照相機(jī)敏感性的提高使共聚焦顯微鏡的分辨率接近點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡的水平，可以用來產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的結(jié)構(gòu)圖像。一個(gè)顯微鏡同時(shí)擁有多個(gè)探頭技術(shù)也將會(huì)出現(xiàn)。CCD探頭工藝提高已經(jīng)應(yīng)用在卡爾蔡司共聚焦顯微鏡上�？�爾蔡司剛剛發(fā)布了一個(gè)新的快速共聚焦系統(tǒng)，即LSM 5 LIVE，它裝配了一種先進(jìn)的線性探測頭。這個(gè)系統(tǒng)是其基于激光的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的一個(gè)補(bǔ)充產(chǎn)品。LSM 510 META是基于激光的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的旗艦產(chǎn)品，它的特征是應(yīng)用了單通道和多通道光電倍增管工藝。它能夠?qū)崿F(xiàn)將多個(gè)熒光圖像收集在一起，而不犧牲其清晰度和效率。

旋轉(zhuǎn)圓盤和點(diǎn)掃描技術(shù)的進(jìn)步

所有共聚焦顯微鏡制造商都在致力于提高其研發(fā)水平和工藝水平，其中旋轉(zhuǎn)圓盤和點(diǎn)掃描型共聚焦系統(tǒng)是重點(diǎn)的研究對象。現(xiàn)在大約有5個(gè)公司基本上都采用相同的材料和工藝生產(chǎn)旋轉(zhuǎn)圓盤，以前的旋轉(zhuǎn)圓盤正在逐漸被淘汰，因?yàn)楝F(xiàn)在設(shè)計(jì)的旋轉(zhuǎn)圓盤只有一個(gè)針孔那么大小。尼康掃頻場共聚焦（SFC）是一個(gè)場掃描共聚焦，除了具有4個(gè)不同的針孔選擇和2個(gè)可利用的縫之外，它更像一個(gè)旋轉(zhuǎn)圓盤共聚焦顯微鏡。而卡爾蔡司的LSM 5 LIVE是現(xiàn)在掃描技術(shù)的一個(gè)重要的補(bǔ)充，這一點(diǎn)從使用過它的科學(xué)家那兒得到的反饋信息可以得到驗(yàn)證�？�爾蔡司的技術(shù)人員總是能夠做到那些看起來不可能做到的事情，他們在不斷的提高共聚焦裝置的速度和敏感性，一直為提高活細(xì)胞成像的質(zhì)量而努力。

共聚焦顯微鏡

在細(xì)胞生物學(xué)中的的應(yīng)用奧林巴斯把Fluoview FV1000共聚焦系統(tǒng)應(yīng)用在細(xì)胞生物學(xué)展示上，它的敏感性有很大提高，并且能在最小的標(biāo)本損傷下實(shí)現(xiàn)活器官的高速掃描。其SIM掃描儀融合了兩個(gè)獨(dú)立的高度同步化的激光掃描儀，這種緊湊的設(shè)計(jì)使得它們能夠?qū)崿F(xiàn)同步的激光刺激和共聚焦觀測。因此，可以在激光刺激后的瞬間，在沒有任何延時(shí)的情況下，捕獲到細(xì)胞產(chǎn)生的快速應(yīng)激反應(yīng)。

尼康有一種十分有趣的軟件技術(shù)，被稱作二維實(shí)時(shí)重疊合法（2DRT）。利用這個(gè)軟件，使用者可以在保持畫面每秒幀數(shù)不變的情況下，實(shí)時(shí)的進(jìn)行圖像的銳化。穩(wěn)定聚焦輔助技術(shù)是另外一項(xiàng)新出現(xiàn)的技術(shù)，通過它可以在數(shù)天內(nèi)保持用戶設(shè)定的一系列焦距，因此可以在最佳的焦距下對標(biāo)本進(jìn)行長時(shí)程的觀測。這項(xiàng)技術(shù)擴(kuò)展了活細(xì)胞成像的可利用時(shí)間范圍，在以后必將會(huì)有日益重要的應(yīng)用。

現(xiàn)在，科學(xué)家的研究范圍不僅僅局限在結(jié)構(gòu)方面，還包括形態(tài)方面的研究。雖然如此，最常使用的仍然是對固定細(xì)胞和組織進(jìn)行2-D和3-D成像。但是不管怎樣，對體外和體內(nèi)狀態(tài)的一系列時(shí)間狀態(tài)下測得的圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行成像和定量分析，是以后發(fā)展的一個(gè)重要方向。在這樣的研究中，保持細(xì)胞的活性非常重要，需要先進(jìn)的技術(shù)和諸如卡爾蔡司LSM 5 LIVE這樣的共聚焦成像系統(tǒng)的支持。

作者：編譯/蔡倫 中科院計(jì)算所