在受激發(fā)射損耗(STED)顯微鏡的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，持續(xù)性的進(jìn)展雖然表現(xiàn)得很慢，但確信可以滿足具有超高分辨率的熒光顯微鏡在方法學(xué)上的需求，而且也許會(huì)給其它的成像模式帶來(lái)一些意想不到的好處。

早在1994年，Stefan Hell首先提出了受激發(fā)射損耗(STED) 顯微鏡的概念，兩年后，這種顯微鏡就展現(xiàn)在人們面前。自從那時(shí)以來(lái)，他領(lǐng)導(dǎo)的研究小組就對(duì)這一技術(shù)進(jìn)行了持續(xù)的改進(jìn)，結(jié)果這一技術(shù)在近期一些奇妙的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮了重要作用。拋開(kāi)這一進(jìn)展不談，這一實(shí)驗(yàn)方法并沒(méi)有被外界廣泛使用，其原因是由于在建設(shè)STED顯微鏡時(shí)需要可調(diào)式脈沖激光，而且我們還會(huì)想起雙光子顯微鏡當(dāng)時(shí)所要面對(duì)的情形：在早期階段，人們并不是十分清楚它帶來(lái)的益處是否會(huì)超過(guò)它的花費(fèi)。

Hell及其同事近來(lái)有兩篇論文出版，一是發(fā)表在《美國(guó)科學(xué)院院刊》，一是發(fā)表在本期的《自然-方法學(xué)》上。這兩篇論文介紹了在STED顯微鏡技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用過(guò)程中所取得的持續(xù)進(jìn)展。發(fā)表在《自然-方法學(xué)》上的報(bào)告，首次闡釋了STED顯微鏡能夠用于熒光蛋白質(zhì)，這是利用STED顯微鏡實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞成像過(guò)程中的重要一步。

發(fā)表在《美國(guó)科學(xué)院院刊》上那篇報(bào)告所介紹的進(jìn)展，具有更為重要的潛在意義。Donnert等人報(bào)告了一個(gè)驚奇發(fā)現(xiàn)--將STED所使用到的配對(duì)照明脈沖之間的間隙寬度進(jìn)行擴(kuò)展時(shí)，導(dǎo)致了更低的光致褪色效應(yīng)和更高的熒光發(fā)射現(xiàn)象。

光致褪色效應(yīng)總能在STED顯微鏡中觀察到，因?yàn)檫@一技術(shù)使用了一種很高的發(fā)光強(qiáng)度，大約是典型的單光子熒光顯微鏡的10-100倍，雖然染色劑并不希望能吸收這一波長(zhǎng)。即使這一強(qiáng)度不到多光子成像激發(fā)強(qiáng)度的百分之一，甚至千分之一，STED顯微鏡使用了與單光子成像技術(shù)中一樣的可見(jiàn)光譜區(qū)和脈沖中相似數(shù)量的光子。

漂白的發(fā)生通常源于熒光團(tuán)轉(zhuǎn)移到一種被稱為“三線態(tài)”的受激能量狀態(tài)。這是一種長(zhǎng)期活躍的狀態(tài)，能在更寬的波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收光子，非常有利于漂白發(fā)生�！昂茱@然，在三線態(tài)和高強(qiáng)STED脈沖之間一定有著某種聯(lián)系，” Hell說(shuō)�！拔覀兇_信，我們能通過(guò)這樣的一種方式改變?cè)O(shè)置，使得重復(fù)率變得更低�！泵}沖之間存在的更長(zhǎng)時(shí)間，應(yīng)當(dāng)為三線態(tài)中的任何分子提供時(shí)間，以便轉(zhuǎn)換回基準(zhǔn)態(tài)。他們稱這種照明方法為三線放松型(T-Rex)STED。

不僅僅減少重復(fù)率導(dǎo)致了漂白效率的降低，而且它還導(dǎo)致熒光信號(hào)強(qiáng)度產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)性的增加。Hell說(shuō)，“信號(hào)增強(qiáng)得如此之大，以致于錄音時(shí)間的有效加長(zhǎng)僅僅通過(guò)4-10這一因子增加，”不管在實(shí)際的照明時(shí)間中有30-80倍的減少。這一簡(jiǎn)單的變化使得它們能夠應(yīng)用一種十倍光強(qiáng)的STED光束。根據(jù)管理STED顯微鏡分辨率的平方根法則，這一十倍光強(qiáng)導(dǎo)致了另一三倍分辨率的增加，降低到20nm，也就是低于衍射柵欄的某一尺度。

雖然降低重復(fù)率導(dǎo)致了發(fā)射強(qiáng)度的極大增強(qiáng)，Hell及時(shí)補(bǔ)充說(shuō)，“這不是我愿意推薦的最終解決方案。真正的方案是快速掃描。如果你掃描得很快，致使僅僅一兩個(gè)脈沖撞擊相同的分子，接著光束會(huì)消失，那么你就取得了相同的效果，但你保持住了來(lái)自樣品的熒光流。”不幸的是，在STED顯微鏡中要實(shí)施快速的掃描在技術(shù)上還不太可能。

STED顯微鏡能否成為一種重要的成像模式，以便能為熒光成像提供超高的分辨率？上述進(jìn)展為此提供了美好的前景。下一個(gè)大的進(jìn)展很可能就是光束掃描。這不僅僅能進(jìn)行活細(xì)胞成像，而且還能提供一個(gè)實(shí)施T-Rex STED的理想方式。

有意思的是，為何T-Rex的益處不應(yīng)當(dāng)推廣到那些像雙光子顯微鏡使用脈沖激光的任何成像模式呢？這并沒(méi)有任何理論上的原因。也許可以發(fā)現(xiàn)，脈沖激光應(yīng)用于T-Rex以獲得傳統(tǒng)的單光子成像可能也有一些優(yōu)點(diǎn)。在改進(jìn)STED顯微鏡技術(shù)的過(guò)程中，如果最終的革新之一是以對(duì)熒光顯微鏡產(chǎn)生普遍性的顯著影響為結(jié)果，那將是很滑稽的。

注：夏雨譯自2006年9月號(hào)的《自然-方法學(xué)》，版權(quán)為英國(guó)NPG出版集團(tuán)所有。