實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求
1. 掌握激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用。
一、激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理
1.普通熒光顯微鏡的不足
使用熒光物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞中的特定成分或結(jié)構(gòu)，不僅圖像與對(duì)比度增強(qiáng)，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長(zhǎng)的紫外光，大大提高了分辯率（δ=0.61 λ/
NA
）。但當(dāng)所觀察的熒光標(biāo)本稍厚時(shí)，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛，原因是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)）。
Laser Scanning Confocal Microscope


2. 共聚焦掃描顯微鏡的成像原理
采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測(cè)器。光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針孔，分別稱為照明針孔和探測(cè)針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對(duì)于焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，即光點(diǎn)通過一系列的透鏡，最終可同時(shí)聚焦于照明針孔和探測(cè)針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會(huì)聚在探測(cè)孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測(cè)孔之外而不能成像。以激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測(cè)針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚焦圖像。
Confocal Principle


每一幅焦平面圖像實(shí)際上是標(biāo)本的光學(xué)橫切面，這個(gè)光學(xué)橫短面總是有一定厚度的，又稱為光學(xué)薄片。由于焦點(diǎn)處的光強(qiáng)遠(yuǎn)大于非焦點(diǎn)處的光強(qiáng)，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)切片。把X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計(jì)算機(jī)軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。

LSCM的基本特點(diǎn)
觀察方式：以熒光為主
光源：激光（紫外、可見光、近紅外）
照明方式：點(diǎn)照明、逐點(diǎn)掃描
成像方式：共聚焦、逐點(diǎn)成像
輸出：實(shí)時(shí)觀測(cè),數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行圖像處理和定量分析多重染色樣品的觀察

3. 共聚焦掃描顯微鏡在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用
細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)（如受體、抗原、抗體、酶、細(xì)胞
骨架蛋白等基因表達(dá)產(chǎn)物）、DNA、RNA等
細(xì)胞膜流動(dòng)性（熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)）
細(xì)胞內(nèi)氧自由基活性
細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化
膜電位



三、試劑與器材
青蛙
冷丙酮、 DAPI 、甘油/PBS封片劑、濾紙、吸管、載玻片、蓋玻片
激光掃描共聚焦顯微鏡

四、實(shí)驗(yàn)步驟
1.取涂有細(xì)胞的載玻片（細(xì)胞涂在中間），冷丙酮40C固定10min;
2.PBS漂洗2次，每次3 min;
3.滴加DAPI溶液100 ul室溫孵育30 min;
4.PBS漂洗3次，每次5min;
5.滴一小滴甘油/PBS封片劑(pH8.5，PBS:甘油=1:9，v/v)封片;
6.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

五、注意事項(xiàng)
注意染色時(shí)間
注意避光