激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope LSCM )是20世紀80年代發(fā)展起來的一項具有劃時代意義的高科技新產品，是當今世界最先進的細胞生物學分析儀器。它是在熒光顯微鏡成象的基礎上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，利用計算機進行圖象處理，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位研究。已廣泛應用于細胞生物學、生理學、病理學、解剖學、胚胎學、免疫學和神經生物學等領域。

一. 組成
倒置或直立熒光顯微鏡、掃描頭(照明針孔、探測針孔、熒光濾片系統(tǒng)、鏡掃描系統(tǒng)和光電倍增管)、掃描頭控制電路、計算機和圖像輸出設備

二. 原理
Confocal
利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現(xiàn)點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。

三. 激光掃描共焦顯微鏡的設計特點:
1.點照明
2.具有照明pinhole和探測pinhole
3.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦), 共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面
4.具有掃描系統(tǒng)―― 逐點掃描成像
5.具有多個（四個） 熒光通道，可同時探測多個被標記物
例如: Leica TCS NT 的技術指標:
1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x
傳統(tǒng)顯微鏡: Rxy=0.61l/NA
Confocal: Rxy=0.4l/NA
2. 樣品的最大厚度:大約 2mm(10X/0.2物鏡)
取決于三點:
物鏡的景深, 與NA成反比
Z軸的最大移動范圍
激光的穿透力
3. 樣品的最小光切厚度: 大約0.35 mm
取決于兩點: 物鏡的數(shù)值孔徑NA
Z軸的最小移動步距: 40nm
Z軸的分辨率: 0.35 mm
4. 激光器
Kr/Ar激光器: 477nm, 488nm, 568nm, 647nm
Ar激光器(UV): 361nm
激光器的特點:
1) 方向性好: 激光基本眼直線傳播
2) 單色性好 l=10-8nm
3) 高亮度: 激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度集中的
4) 偏振性: 激光為平面偏振光, 光纖耦合
5. 四個熒光通道, 一個透射光通道, 即除了可同時采集
多標記熒光圖像外還可以同時采集透射光圖像,但透
射光圖像為非共焦圖像

四. 共焦顯微鏡的類型：
1.點(慢)掃描共焦顯微鏡: 分辨率高, 圖像清晰;
噪音低;
采集圖像速度慢;
目鏡中觀察不到共焦圖像;
2.線(狹縫)掃描共焦 顯微鏡(video rate): 分辨率低;
噪音高;
掃描速度快 240幅/秒;
目鏡中可觀察到共焦圖像
3.Nipkov轉盤式掃描共焦顯微鏡: 性能介于上述兩者之間
功能:1.多熒光標記樣品的圖像采集
2.無損傷、連續(xù)光學切片，顯微“CT”
3.真正的三維重組
4.假三維圖的顯示
5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進行光切
6.定量分析
7.xyt 、xzt、xyzt 和 xt 掃描―― 時間序列掃描
8.圖像處理
9. 旋轉掃描
10.區(qū)域掃描
11.光譜掃描

五、激光掃描共焦顯微鏡技術的應用
定位、定量
三維重組
動態(tài)測量
*活細胞或組織內游離Ca2+濃度的測量
*活細胞內H+濃度（ pH值）的測量
*自由基的檢測
*藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量
應用：細胞膜電位的測量
熒光漂白恢復（FRAP）的測量
籠鎖解籠鎖的測量
熒光能量共振轉移（FRET）的測量

其他應用
1、定位、定量
免疫熒光標記（單標、雙標或三 標）的定位、定量。如：細胞膜受體或抗原的分布，
微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細胞器的共定位
細胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位雜交-fitc + PI
熒光原位雜交： 染色體基因定位
單細胞凝膠電泳
GFP的表達
游離Ca2+ 的分布與定量
定位、定量研究中常用熒光探針
1）Amine-Reactive Probes與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標記等
2）FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/512
3）異硫氰基熒光素 494/518
4）TRITC 四甲基異硫氰基羅丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569
5）Texas Red 德州紅 595/615 BODIPY TR592/618
6）PE 藻紅蛋白 565/578
7）cy3 490/530
8）cy5 650/690

(1)細胞表面抗原、胞內某種蛋白
免役熒光標記： 與抗體耦聯(lián),
直標: 一抗+熒光探針
間標: 二抗+熒光探針 如: 微管蛋白 抗 tublin抗體+熒光探針 肌動蛋白 Palloidine+熒光探針

(2)細胞膜表面受體
配體+熒光探針 如: nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)
標記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+FITC

2.標記細胞器熒光探針
(1)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細胞，陽離子性,可檢測線粒體膜電位, 且在多數(shù)細胞中停留時間短
JC1 線粒體膜電位低時為單體 490/527 發(fā)綠光
線粒體膜電位低時為多聚體 490/590 發(fā)紅光
可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電
位最佳探針: Mitotracker Green FM 490/516, 染活細胞或固定細胞 ,
穩(wěn)定不漏出: Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 還原型, 只能染活細胞
(2)溶酶體 Lysosome中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標記溶酶體等酸性器官為非特異性
AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細胞 LysoTracker Blue LysoTracker
Red
(3)內質網 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標記內質網,較低濃度標記線粒體
(4)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細胞 ¨細胞器的單克隆抗體
(5)細胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死細胞
碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細胞
Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細胞
Hochest 33258 (同上)
DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細胞
Chromomycin A3 450/470 DNA G-C
AO 500/526 DNA 活細胞
460/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死細胞
SYTO 活細胞

3. GFP 綠色熒光蛋白
GFP的的發(fā)現(xiàn)：60年代，Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結合后可產生藍色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經證實在水母體內還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白
GFP, 后經研究表明，在水母體內Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結合后，水母發(fā)光蛋白產生藍色熒光，GFP在藍光的激發(fā)下，產生綠色熒光。將外源基因與GFP DNA
相連, GFP可作為外源基因的報告基因實時監(jiān)測外源基因的表達.
GFP主要應用: 對活細胞中的蛋白質進行準確定位及動態(tài)觀察
如: 可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中的時空表達
GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉染細胞, 可動態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細胞外的過程
GFP基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細胞中細胞核、內質網、高爾基體、線粒體等細胞器的
結構及病理過程:定位與定量測量應注意的問題
定位：1.可以對圖像進行修飾，
2.pinhole 可盡可能的小。
3.確認共定位時要取兩個通道熒光相互干擾的對照圖像

定量：
1.儀器的各個條件必須一致
2.必須用原始圖像進行定量測量
3.Pinhole盡可能的大

六.顯微CT與三維重組
光切的層數(shù)：VoxelsizeZ £ 2VoxelsizeX
七.動態(tài)測量 Physiology:細胞內離子動態(tài)變化測量
1).游離Ca2+測量
檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結合時不發(fā)熒光，通常也不能進入細胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進入細胞內，被細胞內酯酶水解后并與胞內游離鈣結合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10xkd,
Kd和很多因素有關，如pH、 Mg2+、與蛋白的結合、溫度等。細胞內生理Ca2+濃度值(10-100n
M)，細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）
熒光探針 激發(fā)波長 發(fā)射波長 Kd
FLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM
Fluo4 506nm 525nm
Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM
Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM
Fura red 420/480nm 637nm 140nM
Oregon Green 488 494nm 520nm 20,000nM
Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM
Indo-1 356nm 405/458nm 230nM
Fura-2 340/380 476nm 145nM

相對測量
DF/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)
Ca2+濃度絕對測量
單波長公式法
Fluo3: 530nm Kd=450nM
[Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)
Fmin: 細胞內無鈣時的熒光強度( MnCl2)
Fmax：細胞內鈣飽和時的熒光強度(A23187)
測量時切記細胞內靜息Ca2+濃度的相對熒光強度值不能太低（F值不低于40）
細胞內生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M）
細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）
標準曲線法：根據(jù)儀器條件和負載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer(EGTA-
Ca2+)做標準曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強度
比例熒光的測量：雙波長(比例熒光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380,
440)[Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2

細胞器的Ca2+測量
1.線粒體內游離Ca2+測量 Fluo-3 + TMRM(線粒體熒光探針，紅色）
2. 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白 水母發(fā)光蛋白與 Ca2+結合后發(fā)藍光
用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細胞器蛋白的表達載體轉染細胞，可測定亞細胞器內的游離Ca2+變化目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內質網、細胞核內的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal
檢測

細胞內游離Ca2+測量的應用：
鈣的特性
1．細胞內外的電化學梯度103-104倍
2．細胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導致胞內鈣明顯升高
3．細胞內鈣為細胞激活“開關”

細胞內鈣的生理作用
1．肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián)
2．神經遞質的釋放
3．學習記憶的增強
4．卵子受精
5．細胞分裂和再生
6．細胞調亡
7．細胞間通訊
8．細胞信號傳導
9. DNA合成

10. 基因表達
細胞內鈣超載與疾病
1．高血壓、腦缺血、心臟病、內分泌病―胞內鈣濃度異常
2．糖尿病、風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化病―胞內鈣濃度增高
3．人體缺鈣―骨鈣大量丟失，神經細胞的鈣濃度增高
4．老化和老年性癡呆-神經細胞內鈣濃度增高
細胞內生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M），細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）

八.熒光漂白恢復(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching)
定義:經熒光探針標記的細胞的某一區(qū)域一旦被高強度的激光照射后,熒光物質的光化學結構被迫壞,熒光強度下降, 且為不可逆的過程, 但此處熒光強度會漸漸恢復,
熒光強度和恢復的快慢和多少,代表周圍分子擴散的速率, 或分子運動速度。
R=(I2-I1 /I0-I2)100%
R-熒光漂白恢復率：代表分子的運動速度
應用：細胞間通訊， 細胞膜流動性，蛋白分子的運動

九.籠鎖解籠鎖的測量
定義：籠鎖化合物全稱為光致不穩(wěn)定籠鎖化合物，為人工合成的用隱蔽基團修飾生物活性分子的化合物，一旦被紫外光照射，兩者間的共價鍵幾解離而釋放出活性分子，這一光解作用稱為解籠鎖。
籠鎖化合物的種類：籠鎖的神經遞質、籠鎖的第二信使、籠鎖鈣等

十．熒光能量共振轉移( fluorescence Resonance Energy
Transfer)能量轉移：能量從分子的一個部位向另一個部位的傳遞，或能量從一個分子向另一個分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。
能量共振轉移：分子可以看作為正負電荷分離的一個偶極子，受激發(fā)以一定的頻率振動，如果其附近有一個振動頻率相同的另一分子存在，則通過這兩個分子之間的偶極-偶極相互作用，能量可以非輻射方式從前者轉移到后者，這種能量轉移稱為共振轉移。
熒光能量共振轉移的條件
兩個熒光分子：供體-FL1，受體-FL2供體與受體的距離在2-7nm，供體的發(fā)射波長與受體的激發(fā)波長一致
檢測：
以FL1的激發(fā)波長的光照射樣品，沒有共振轉移時，只檢測到FL1的發(fā)射光(綠光)，發(fā)生共振轉移時，就可檢測出FL1的熒光(綠光)減弱，F(xiàn)L2(紅光)的增強。
應用：檢測大分子的相互作用
大分子構象的改變(蛋白)，例：大分子(亞基)的結合與分離受體與配體的結合 ，常用熒光探劑：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP

十一 .其它應用
生物材料,例: 細胞在生物材料中的生長狀態(tài)及分布

激光掃描共焦顯微鏡的發(fā)展趨勢：
連續(xù)光譜型Confocal
多光子激光掃描顯微鏡