1992年，Sano等人將免疫測定技術(shù)與PCR結(jié)合，創(chuàng)建了一種全新的極其敏感的抗原分子檢測技術(shù)，即免疫-PCR（Immuno-PCR），隨著這種技術(shù)的不斷發(fā)展，2000年，Sim等使用熒光定量PCR代替普通PCR，發(fā)展了免疫定量PCR技術(shù)（real-timeimmuno-PCR）。該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機(jī)結(jié)合起來，其本質(zhì)是一種以PCR擴(kuò)增一段DNA報(bào)告分子代替酶反應(yīng)來放大抗原抗體結(jié)合率的一種改良型ELISA。

1) real-timeimmuno-PCR的基本原理
real-timeimmuno-PCR主要由兩個(gè)部分組成。第一部分是類似于普通酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的抗原抗體反應(yīng)。第二部分即熒光定量PCR。real-timeimmuno-PCR與ELISA的區(qū)別就在于ELISA是以堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶來標(biāo)記抗體，用顏色反應(yīng)來表明陽性或陰性結(jié)果，而前者是以一段特定的雙鏈或單鏈DNA來標(biāo)記抗體，用PCR擴(kuò)增抗體所連接的DNA，因此可由PCR產(chǎn)物的量來反映抗原分子的量。由于熒光定量PCR的高靈敏度，只要存在著極微量的抗原抗體反應(yīng)，都能被檢測到。real-timeimmuno-PCR的關(guān)鍵之處就在于用一個(gè)連接分子將一段特定的DNA連接到抗體上，在抗原和DNA之間建立相對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而將對(duì)蛋白質(zhì)的定量檢測轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)核酸的定量檢測。

2) real-timeimmuno-PCR體系的組成
免疫PCR體系由待檢抗原，特異性抗體，連接分子，DNA和PCR擴(kuò)增系統(tǒng)組成。
1．待檢抗原被檢測的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相，這一過程與ELISA試驗(yàn)是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能應(yīng)用目前介紹的免疫PCR方法進(jìn)行檢測，需要對(duì)免疫PCR進(jìn)行改進(jìn)，以便能夠檢測吸附性差的抗原。免疫PCR的后續(xù)過程需PCR擴(kuò)增，目前有些方法應(yīng)用的固相板或管是專門用于免疫PCR，并且有些PCR僅可以直接用微量板進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可以簡化實(shí)驗(yàn)過程和提高檢測的精確性。免疫PCR具有非常高的敏感性，特別適用于檢測微量抗原。
2．特異抗體免疫PCR中的特異性是對(duì)應(yīng)于待測抗原，與ELISA一樣，抗體的特異性和親和力將影響免疫PCR的特異性和敏感性。一般均選用單抗體，這個(gè)抗體常采用生物素標(biāo)記，通過親和素再結(jié)合DNA。
3．連接分子連接分子是連接特異抗體與DNA之間的分子。Sano等用鏈親和素/蛋白A(striptavidin-proteinA)基因工程融合體作為連接分子來連接生物素標(biāo)記的DNA與抗體，此種融合蛋白的鏈親和素部分可識(shí)別DNA上的生物素，蛋白部分可識(shí)別抗體的Fc段。
4．DNA和PCR系統(tǒng)免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶將結(jié)合于固相上的DNA特異放大，由此定量檢測抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是借助了PCR強(qiáng)大的擴(kuò)增能力。免疫PCR中的DNA分子可以選擇任何DNA，但要保證DNA的純度，且有較好的均質(zhì)性，盡可能不選用受檢樣品中可能存在的DNA。一般可選用質(zhì)粒DNA或PCR產(chǎn)物等。DNA的生物素化是用生物素標(biāo)記的dATP或dUTP通過聚合酶標(biāo)記在DNA分子上，一般是1個(gè)分子DNA標(biāo)記2個(gè)生物素，標(biāo)記率可達(dá)百分之百。免疫PCR的PCR擴(kuò)增系統(tǒng)與一般PCR一樣，主要包括引物、緩沖液和耐熱DNA聚合酶。
一種新的高靈敏度的葡萄球菌腸毒素A(SEA)的檢測方法――定量免疫PCR
摘要：葡萄球菌腸毒素是細(xì)菌超抗原蛋白家族中的一種多肽，除了天然的超抗原性外，它還是腸胃毒素蛋白，嚴(yán)重危害人的健康。由于現(xiàn)在常用的免疫學(xué)檢測方法在靈敏度和特異性方面不高，因此需要建立一種新的高靈敏度方法用于檢測葡萄球菌腸毒素（SE）抗原。

為了提高SE檢測的靈敏度，我們建立了全新的極其敏感的免疫定量PCR方法，該技術(shù)結(jié)合了特異性強(qiáng)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ELISA）和靈敏度高的熒光定量PCR。包被SEA的ELISA板被生物素標(biāo)記的抗SEA抗體特異性識(shí)別，這種信號(hào)隨著通過對(duì)結(jié)合在抗體上的DNA進(jìn)行定量PCR而加強(qiáng)放大。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，免疫定量PCR最低能檢測出30pg的SEA，是ELISA的100倍。
對(duì)于感染了含有致熱毒素超抗原的葡萄球菌的宿主，免疫定量PCR能檢測出這種宿主中的極其微量的外毒素的含量。

結(jié)果和討論：
免疫PCR因其高靈敏度而能夠檢測微量蛋白，但也往往由于非特異性抗體影響而導(dǎo)致假陽性結(jié)果，即使用過量的BSA或牛奶封閉液、減少PCR循環(huán)次數(shù)，假陽性仍然嚴(yán)重。但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用LowCross緩沖液在不減少檢測靈敏度的情況下能有效的降低非特異性反應(yīng)。（圖2）
第一種免疫PCR使用常規(guī)PCR反應(yīng)，通過EB染色和瓊脂糖凝膠電泳最低能檢測300pg的SEA。（圖2）

圖2：SEA的免疫PCR檢測：左邊：沒有使用LowCross緩沖；右邊：使用了LowCross緩沖。這次實(shí)驗(yàn)中蛋白的檢測下線是300pg/100ul。
進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中采用了定量PCR反應(yīng)，大大提高了檢測靈敏度，SEA的檢測下線是 6pg/100ul，而ELISA是6ng/100ul，常規(guī)免疫PCR也只能達(dá)到300pg/100ul，并且SEA蛋白定量準(zhǔn)確，無需PCR后處理。

高分辨率熔解曲線（HRM）進(jìn)行SNP基因分型
隨著定量PCR儀設(shè)計(jì)上的不斷改進(jìn)，對(duì)溫度控制的精密性越來越高，出現(xiàn)了像Rotor-Gene這樣的管間溫度均一性達(dá)±0.01℃的定量PCR儀，而該公司新近推出的Rotor-Gene6000更可達(dá)到±0.02℃的溫度分辨率。溫度上的高分辨率使得運(yùn)用定量PCR儀進(jìn)行高分辨率熔解曲線（HRM）分析基因型成為可能。高分辨率熔解曲線根據(jù)序列長度、GC含量和互補(bǔ)性分析樣品。不同的核酸序列，哪怕僅有一個(gè)堿基的差異，也會(huì)體現(xiàn)在熔解溫度的差別上。基因分型單核苷酸多態(tài)性（SNP）是最典型的應(yīng)用，相比其它方法節(jié)約了探針和標(biāo)記的費(fèi)用，僅需監(jiān)測模板熔解溫度的不同即可對(duì)不同的樣品進(jìn)行分型。當(dāng)然，要達(dá)到如此高的分辨率，定量PCR儀必需具備高強(qiáng)度的光源、高速的數(shù)據(jù)采集、精確的溫度控制和極佳的溫度分辨能力。除此之外，第二代的dsDNA內(nèi)摻式染料，如LCGreen.