簡介

 

      成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。骨不斷地進行著重建，骨重建過程包括破骨細胞貼附在舊骨區(qū)域，分泌酸性物質(zhì)溶解礦物質(zhì)，分泌蛋白酶消化骨基質(zhì)，形成骨吸收陷窩；其后，成骨細胞移行至被吸收部位，分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)礦化而形成新骨。破骨與成骨過程的平衡是維持正常骨量的關(guān)鍵。成骨細胞起源于多能的基質(zhì)的間質(zhì)細胞，除成骨細胞外，基質(zhì)細胞還可分化成軟骨細胞，成纖維細胞，脂肪細胞或肌細胞。

 

      軟骨細胞（chondrocyte）:位于軟骨陷窩內(nèi)。幼稚的軟骨細胞位于軟骨組織的表層，單個分布，體積較小，呈橢圓形，長軸與軟骨表面平行，越向深層的軟骨細胞體積之間增大呈圓形，細胞核圓形或卵圓形，染色淺，細胞質(zhì)弱嗜堿性，常見數(shù)量不一的脂滴。成熟的軟骨細胞多2~8個成群分布于軟骨陷窩內(nèi)，這些軟骨細胞由同一個母細胞分裂增殖而成，稱為同源細胞群。電鏡下，軟骨細胞有突起和皺褶，細胞質(zhì)內(nèi)有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達的高爾基復(fù)合體及少量的線粒體。在組織切片中，軟骨細胞收縮為不規(guī)則形，在軟骨囊和細胞之間出現(xiàn)較大的腔隙。

 

      破骨細胞(osteoclast，亦稱bone-resorbing cells)是骨細胞的一種，行使骨吸收（bone resorption）的功能。破骨細胞與成骨細胞（osteoblast，亦稱bone-forming cells）在功能上相對應(yīng)。二者協(xié)同，在骨骼的發(fā)育和形成過程中發(fā)揮重要作用。高表達的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase)和組織蛋白酶K（cathepsin K)是破骨細胞主要標志。

 

 

漢恒生物研究實例

 

C3H10T1/2成骨&成軟骨分化報告

 

1、 C3H10T1/2細胞的培養(yǎng)，傳代，凍存與復(fù)蘇

 

C3H10T1/2細胞的形態(tài)：

 

 

 

2、成骨分化實驗

 

方法：

2.1 成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)

2.2 堿性磷酸酶（ALP）定量

2.3 茜素紅染色

2.4 Q-PCR檢測成骨分化指標

2.5 Western blotting法檢測相關(guān)成骨marker的表達

 

結(jié)果：

1. 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，各時間點細胞狀態(tài)：

 

 

2. 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天，ALP染色：

 

 

3. 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天，ALP定量：

 

 

4. 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)各時間點，茜素紅染色：

 

 

5. 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，各時間點Q-PCR法檢測相關(guān)成骨marker的表達：

 

 

6. 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，各時間點Western blotting法檢測相關(guān)成骨marker的表達：

 

 

 

 

3. 成軟骨分化實驗

 

方法和步驟：

3.1 成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng) (micromass 法)

3.2 阿辛藍染色

3.3 Q-PCR檢測各時間點成軟骨分化指標

3.4 Western blotting法檢測各時間點成軟骨分化指標

3.5 免疫組化檢測成軟骨培養(yǎng)各時間點II型膠原的表達

 

結(jié)果：

1. Micromass法，成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)各時間點軟骨團塊形態(tài)：

 

 

2. Micromass法，成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，各時間點阿辛藍染色：

 

 

3. Micromass法，成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)， Q-PCR法檢測各時間點相關(guān)軟骨marker的表達：

 

4. Micromass法，成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)， Western blotting法檢測各時間點相關(guān)軟骨marker的表達：

 

 

5. Micromass法，成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，各時間點免疫組化法檢測II型膠原的表達：

 

 

 

 

SQSTM特定位點突變對破骨細胞分化的影響實驗報告

 

     RAW264.7細胞是一種鼠源的巨噬細胞系，RAW264.7細胞貼壁快，形態(tài)以類圓形和不規(guī)則為主，一般1～2個核，極少數(shù)有3個核，胞漿伸展時胞體較大。細胞貼壁緊，胰酶-EDTA難以消化，需要多次消化吹打，也可采用細胞刮法。

    在RANKL的誘導(dǎo)下，RAW264.7細胞可以分化為成熟的破骨細胞，此時應(yīng)用破骨細胞特異性的抗酒石酸酸性磷酸染色（TRAP染色），在有成熟破骨細胞的部位可見紅色的陽性反應(yīng)，所以一般認為RAW264.7是一種前成破骨細胞。 

    RAW264.7細胞向破骨細胞的分化是一個NF-kb通路依賴的過程，先前的大量研究表明，NF-kb通路受到抑制時，RAW264.7細胞不能向破骨細胞的分化。

    目前一般認為Sequestosome 1/p62 (p62，即SQSTM蛋白基因)基因的產(chǎn)物可以抑制NF-kb通路的活性，當Sequestosome 1/p62 (p62，即SQSTM蛋白基因)基因發(fā)生突變時，NF-kb通路的活性變強。

 

實驗結(jié)果圖：