西寶生物科技（上海）股份有限公司

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西寶生物（Seebio）特色產(chǎn)品：糖類標準品，脂肪酸標準品，花青素標準品，類胡蘿卜素標準品等食品分析標準品

基因高效快速表達試劑盒介紹（第四版）

 （菌種部分修改TOP10為JM109，凍干菌種變?yōu)榇┐叹�種！） 

名稱           基因高效快速表達試劑盒    

貨號           2001-1K

包裝規(guī)格       一家實驗室購買一套可永久無限次使用

試劑盒組成    （1）9種表達載體

              （2）2種凍干菌種

              （3）2種抗生素

一、產(chǎn)品簡介

二、基因克隆

三、基因表達

四、載體資料

五、相關產(chǎn)品

六、參考文獻

七、試劑盒質(zhì)量驗收標準

 一、產(chǎn)品簡介

原核表達系統(tǒng)近年來研究取得突破性進展

       1998年，美國Incyte Pharmaceutical公司華裔科學家Zhang Yang在《Protein expression and purification》(vol12,159-165)上發(fā)表論文《Expression of Eukaryotic proteins in soluble form in Escherichia coli》，文章采用E.coli分子內(nèi)伴侶DsbA技術將IGF-I、IGFBP-3、3Cproteinase、TGFb-2、STGFb-RII、BDNF、GDNF、mEGFBP、Leptin和GFP十個基因全部實現(xiàn)了可溶性表達，且表達量均大于25%。更為驚奇的是由于DsbA分子伴侶的作用使得擁有9個半胱氨酸的復雜結(jié)構的IGFBP-3能在E.coli內(nèi)形成可溶性具生物活性的高表達重組蛋白。
      2002年，美國冷泉港實驗室出版的《Protein Science》(2002,11:313-321)上發(fā)表了瑞典科學家Torleif《Rapid screening for improved solubility of small human proteins produced as fusion proteins in Escherichia coli》一文，從而揭開了原核高效快速組合篩選表達系統(tǒng)用于蛋白組學研究的序幕。
       近年來Medline報導了大量利用原核表達獲得有活性的可溶蛋白，現(xiàn)舉例如下：

 產(chǎn)品特色

      上海西寶生物科技有限公司通過和留美學者合作，現(xiàn)向國內(nèi)推出原核基因高效快速表達試劑盒。它將九種表達載體包括分泌型、引導分泌型、胞內(nèi)直接表達型、分子內(nèi)伴侶協(xié)助折疊型、高度穩(wěn)定伴侶型等系統(tǒng)的多克隆位點統(tǒng)一，同時統(tǒng)一了誘導表達劑和統(tǒng)一了培養(yǎng)基，一次可以同時克隆九種載體進行表達篩選，極大地節(jié)省寶貴的科研時間。其實，象美國Amgen、Gentech、Incyte這類頂尖的生物技術公司也是采用多系統(tǒng)多載體同時篩選快速表達的策略。這一策略的最大優(yōu)勢就是快速且成功率高。本系統(tǒng)非常適合高通量快速篩選大量未知基因，對基因組學和蛋白組學的研究是一個不可缺少的工具。

1）凍干菌種可長期穩(wěn)定保存。
2）提供詳實的操作說明和豐富的參考文獻。
3）下游多種親和層析組合方便您快速純化目的蛋白。
4）分子內(nèi)伴侶和分泌表達能最大限度避免包涵體形成，直接獲得有活性可溶蛋白，這一點對于未知基因功能的研究很重要。
5）九套高效表達載體同時克隆篩選極大地節(jié)省您寶貴的科研時間。
6）T7溶菌酶和lacIq阻遏蛋白能起到嚴格控制誘導前表達的作用，同時強啟動子、高拷貝復制子等方法結(jié)合可獲得高達50%的表達量。
7）已有200多個基因通過該試劑盒表達成功。 
      

       本試劑盒包括凍干菌株、抗生素和統(tǒng)一多克隆位點的九種表達載體。用戶只要擴增出一段不帶終止密碼子或帶終止密碼子的閱讀框編碼基因克隆進九種表達載體，可同時篩選，節(jié)省時間。一般兩至三周可以篩選出表達菌株，在此基礎上，進一步根據(jù)需要進行實驗室菌株的優(yōu)化從而成為工程菌株。

       本試劑盒采用的技術路線如下：

       本試劑盒由上海西寶生物科技有限公司與留美學者共同開發(fā)并在中國申請了組合發(fā)明專利。由于大腸桿菌表達系統(tǒng)遺傳背景清楚、易于大規(guī)模發(fā)酵等優(yōu)點，尤其是近年來采用分子內(nèi)伴侶的技術（如Trx、DsbA等）使得許多外源基因能在E.coli里正確折疊，如IL-11、GM-CSF、INF、 Insulin甚至包括結(jié)構復雜的tPA等均可獲得正確折疊的重組可溶性活性蛋白，使得E.coli高效快速表達系統(tǒng)仍然是分子生物學實驗室一個不可缺少的工具。

       本試劑盒包括凍干菌株、抗生素和統(tǒng)一多克隆位點的九種表達載體。用戶只要擴增克隆出一段不帶終止密碼子或者帶終止密碼子的閱讀框編碼基因克隆進九種表達載體，可同時篩選，節(jié)省時間。一般兩至三周可以篩選出表達菌株，在此基礎上，進一步根據(jù)需要進行實驗室菌株的優(yōu)化從而成為工程菌株。

       pLLP-OmpA表達載體采用E.coli強啟動lpp和OmpA分泌信號肽，同時在C端添加了6個His可采用chelating sepharose親和層析純化目標蛋白。該表達載體成功地實現(xiàn)過人生長激素的基因工程工業(yè)化。經(jīng)多年臨床驗證，分泌型重組人生長激素臨床副反應大大低于包涵體型的重組人生長激素。

      pLLP-STII表達載體采用E.coli強啟動lpp和STII分泌信號肽，同時在C端添加了6個His便于采用chelating sepharose親和層析純化目標蛋白。STII信號肽引導能力強且易于被E.coli信號肽酶切割。即使第一個氨基酸是半胱胺酸的干擾素也可以實現(xiàn)分泌表達。

       pMBP-P表達載體采用E.coli tac啟動子和分泌型麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein）同時選用凝血酶切割位點并在C端添加6個His便于采用chelating sepharose親和層析純化目標蛋白。該表達系統(tǒng)在Medline里有大量的背景文獻參考。它通過MBP引導分泌，可以實現(xiàn)許多基因在周質(zhì)空間里正確折疊，如TPO（1-153aa）、GM-CSF、IL-2等。我們采用這一表達系統(tǒng)配合固相化的凝血酶成功地獲得了正確折疊的rhGM-CSF，臨床試用表明其副反應比包涵體型rhGM-CSF大大降低。該表達載體表達的蛋白還可通過Amylose親和層析。

       pMBP-C表達載體采用E.coli tac啟動子和胞內(nèi)可溶性麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein），同時選用凝血酶切割位點并在C端添加6個His便于采用chelating sepharose親和層析純化目標蛋白。該表達系統(tǒng)在Medline里有大量背景文獻參考。它通過MBP胞內(nèi)融合表達，表達產(chǎn)物可占菌體的20%-30%，可形成可溶性蛋白，也可形成包涵體。融合蛋白還可以通過Amylose親和層析純化。

       pET-GST表達載體采用T7啟動子和GST融合表達，同時選用人鼻病毒14亞型3C蛋白酶專一性切割位點。本公司有高純度的重組人鼻病毒14亞型3C蛋白酶出售，同時還有專一性吸附該蛋白酶的樹脂出售。此外，C端還添加了6個His，便于采用chelating sepharose親和層析。本載體表達的融合蛋白可采用吸附GST的親和層析和6個His的chelating sepharose雙重親和層析，極大地方便了下游純化。GST融合表達背景文獻在medline里極為豐富，有數(shù)百個基因采用GST融合表達成功。

       pET-Trx表達載體采用蛋白質(zhì)工程改造的硫氧還蛋白即將其中兩個氨基酸突變成His，使硫氧還蛋白在空間立體結(jié)構上形成三個組氨酸位點（His-patch），便于采用chelating sepharose親和層析。該表達載體采用T7啟動子和（His-patch）Thioredoxin融合表達，同時選用人鼻病毒14亞型3C蛋白酶專一性切割位點。硫氧還蛋白作為分子內(nèi)伴侶可以幫助許多基因在E.coli胞內(nèi)正確折疊如IL-3、IL-6、IL-11等。

      pET-His表達載體采用N端6個His和T7啟動子。高效表達產(chǎn)物的N端具備6個His，便于采用chelating sepharose 親和層析純化目標蛋白。同時該載體選用了凝血酶專一性切割切點。融合蛋白既可以采用高純度限制級的凍干凝血酶液體切割，也可以采用固相化凝血酶切割。

     pTrc-CKS表達載體采用E.coliTrc啟動子和蛋白質(zhì)工程改造過CKS (CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonate cytidylyltransferase or CMP-KDO synthetase)基因融合表達，同時選用人鼻病毒14亞型3C蛋白酶專一性切割位點。CKS融合表達是美國Abbot公司的專利，CKS融合蛋白研制成功HIV和HCV重組抗原并取得FDA認證在美國上市。CKS是一個非常穩(wěn)定且高度可溶的理想融合伴侶。本發(fā)明除去掉CKS C端8個氨基酸外，還將C端Met突變成Thr，一方面可報自已的專利，另一方面有利于基因表達。

       pET-DsbA表達載體采用T7啟動子和DsbA基因融合表達，同時選用凝血酶切割位點。DsbA是近年來發(fā)現(xiàn)幫助二硫鍵形成的重要分子內(nèi)伴侶之一。本試劑盒DsbA基因去掉了信號肽，同時將DsbA氧化還原功能相關的兩個半胱氨酸（cys）突變成絲氨酸（ser），這樣與突變后的DsbA融合可實現(xiàn)許多基因的胞內(nèi)可溶性有活性的高表達（表達量大于30%），如IGF-1、IGFBP、EGF、Insulin等。

      本試劑盒還將兩種E.coli菌株凍干方便長期保存。

 二、基因克隆

1、本試劑盒選用兩種大腸桿菌菌株

兩者基因型分別為：

E.coli TOP10F¢

Fˊ{lacI^q Tn10(Tet^R)} mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80 lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Str^R)endA1 nupG 

E.coli BL21(DE3)plysS

F^- ompT hsdS_B (r_B^-m_B^-)gal dcm(DE3)pLysS(Cam^R)

2、兩種大腸桿菌菌株使用情況

這一點非常重要，務必分清。

（1）九種載體的擴增須采用E.coli TOP10F¢，而不能采用E.coli BL21(DE3)plysS。

（2）九種載體的目的基因克隆須采用E.coli TOP10F¢，而不能采用E.coli BL21(DE3)plysS。

（3）克隆了目的基因的表達載體，其中1、2、3、4和8號載體即pLLP-OmpA、pLLP-STII、pMBP-P、pMBP-C和pTrc-CKS應轉(zhuǎn)化進E.coli TOP10F¢進行誘導表達。5、6、7和9號載體即pET-GST、pET-Trx、pET-His和pET-DsbA應轉(zhuǎn)化進E.coli BL21(DE3)plysS進行表達。

3、原始種子庫和實驗種子庫的建立

       一般分子生物學和基因工程實驗室常用來擴增質(zhì)粒的菌株E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli HB101等，常常從別的實驗室轉(zhuǎn)種而來，對其基因型缺乏確切的驗證。學生在實驗研究中常常用LB平板連續(xù)傳代，有時一個學期就靠平板上傳代來培養(yǎng)感受態(tài)等試驗。這樣表面上看來很方便，但事實上由于微生物容易發(fā)生突變，這就造成了克隆實驗中轉(zhuǎn)化效率不高、轉(zhuǎn)化涂平板時出現(xiàn)氨芐抗性的小菌落、提取的質(zhì)粒酶切時易于降解甚至出現(xiàn)基因重組突變之類的實驗怪現(xiàn)象，這些小問題往往造成實驗進程受阻，更糟的是很難分析原因。

      為了根本上克服這個問題，我們將建議您購買本試劑盒后第一件事就是建立原始種子庫、試驗種子庫和感受態(tài)種子庫。

1）E.coli TOP10Fˊ凍干菌株和E.coli BL21(DE3)plysS凍干菌株，為原始種子庫，于-20^oC長期保存。

2）從凍干的原始種子庫中取一支里面凍干的少許粉末，加入10ml LB液體培養(yǎng)（其中E.coli TOP10Fˊ具四環(huán)素抗性，10ml LB液體培養(yǎng)基加5ml(濃度為5mg/ml)四環(huán)素；E.coli BL21(DE3)plysS為氯霉素抗性，10ml LB液體培養(yǎng)基加5ml(濃度為25mg/ml)氯霉素。）37^oC，150轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)過夜。

3）第二天轉(zhuǎn)種1ml至40ml液體LB培養(yǎng)基（抗生素添加方法同上，注意E.coli TOP10Fˊ抗四環(huán)素，E.coli BL21(DE3)plysS抗氯霉素）。37 ^oC，200轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)3-4小時，至OD600 0.4-0.5之間，取一半用15%的滅菌甘油各保存50支(-70 ^oC)，即成試驗種子庫。另一半用SSCS溶液制備感受態(tài)，分裝于每支120ml   50-100支于-70 ^oC保存，即成感受態(tài)種子庫。

4）如沒有SSCS溶液，今后可每次從試驗種子庫里選一支劃LB平板，用后即棄去。可用CaCl₂法制備新鮮感受態(tài)，一般CaCl₂法感受態(tài)在4 ^oC可保存兩至三天。平板上菌株保存時間不超過三周，避免反復連續(xù)在LB平板上傳代。

4、九種表達載體質(zhì)粒的擴增

       本公司試劑盒里提供的九種表達載體經(jīng)DNA序列分析、表達試驗、酶切分析、熱穩(wěn)定（37 ^oC）等測試，我們建議您克隆目的基因前將上述九種載體轉(zhuǎn)化進E.coli TOP10Fˊ,自己提質(zhì)粒, 試劑盒的原始質(zhì)粒于-20 ^oC長期保存。具體實驗方法為：

1）制備E.coli TOP10Fˊ感受態(tài)，可采用CaCl₂新鮮制備，也可采SSCS溶液制備的-70^oC保存感受態(tài)。

2）各取1ml九種原始質(zhì)粒并設負對照一個轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方法參見《分子克隆》。

3）LB固體平板可采用《分子克隆》的配方或營養(yǎng)瓊脂均可，注意添加氨芐抗生素。

4）挑單菌落，提取九種載體質(zhì)粒。

5）根據(jù)說明書提供的載體特征大小和酶切位點進行鑒定。

5、目的基因的擴增和酶切位點的選擇

1）本試劑盒選用了統(tǒng)一的多克隆位點為

GGA TCC GCA GAA TTC AGC GCT AGC CAC（TAA） CAT CAT

  BamHI        EcoRI         NheI    His        His His     

CAT CAT CAT TAA GCTT

 His His  His    HindIII

       我們建議您擴增基因5 ¢端選BamHI或BglII，3¢端選NheI或XbaI或SpeI，同時3¢端不要帶終止密碼子，注意與GGA TCC（Gly Ser）表達框架正確，載體用NheI-BamHI雙酶切。BamHI和BglII為同裂酶，NheI、XbaI和SpeI為同裂酶。

如您目的基因無法滿足上述要求，如同時含有BamHI和BglII，5¢端可選擇EcoRI，但須注意與表達框架GAA TTC（Glu Phe）對齊。如您目的基因同時含有XbaI、NheI和SpeI，3¢端可選擇EcoRI。

如果您的目的基因已帶有終止密碼子，同樣可以進行克隆表達，只是注意有些表達載體是在C端帶6個His。

PCR引物設計時BamHI和EcoRI位點的5¢端保護堿基有2至3個GC即可，而XbaI、NheI和SpeI位點5¢端保護堿基須在5個左右才容易被酶切割。  

6、我們建議您PCR產(chǎn)物先克隆至T-載體上，選單菌落進行DNA序列分析正確后，再進行克隆表達。這是由于PCR擴增過程中容易出錯，直接進行表達分析相關因素就更復雜了。

7、基因克隆后建議您通過雙酶切或PCR或DNA測序鑒定確認。

基因高效快速表達試劑盒載體測序引物

• 一） pLLp-OmpA

正向測序引物為5 GGC TTT ACA CTT TAT GCT TC 3

反向測序引物為 5CCA TTT TTC ACT TCA CAG G 3

• 二） pLLp-STII

正向測序引物為5 GGC TTT ACA CTT TAT GCT TC 3

反向測序引物為 5CCA TTT TTC ACT TCA CAG G 3

• 三） pMBp-P

反向測序引物為通用引物M13/PUC SEQUENCING PRIMER

5 CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3

• 四） pMBp-C

反向測序引物為通用引物M13/PUC SEQUENCING PRIMER

5 CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3

• 五） pET-GST

反向測序引物為通用引物T7 terminator primer

   5 GCT AGT TAT TGC TCA GCG G 3

• 六） pET-Trx

反向測序引物為通用引物T7 terminator primer

   5 GCT AGT TAT TGC TCA GCG G 3

• 七） pET-His

正向測序引物為通用引物T7 promoter primer

5 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3

反向測序引物為通用引物T7 terminator primer

   5 GCT AGT TAT TGC TCA GCG G 3

• 八） pTrc-CKS

正向測序引物為5 ATC CAT GTT GCT GTT GCT CAG G 3

反向測序引物為5 GAT TTA ATC TGT ATC AGG 3

• 九） pET-DsbA

反向測序引物為通用引物T7 terminator primer

   5 GCT AGT TAT TGC TCA GCG G 3

三、基因表達

1、載體的選擇

   您在進行克隆表達前須仔細閱讀九種載體的相關文獻資料。

   第一次實驗時，我們建議您先其中四個載體即3號、7號、8號和9號載體進行克隆表達。如果3號載體表達可分泌到周質(zhì)空間，您可以進行1號和2號載體的直接分泌表達試驗。一般8號載體均可以表達且克隆進E.coli Top 10F'后提取質(zhì)粒的同時可以進行表達試驗。

2、表達培養(yǎng)基（固體）的選擇

   表達培養(yǎng)基（固體）有兩種配方，配方一采用常見的LB配方，這一配方比較常用，大多基因表達均可采用這一配方。注意事項如下：

   1）固體平板倒好后一定要在室外溫下放置24小時，以使表面變干，否則影響表達。

   2）添加0.2%葡萄糖有利于表達。

   3）選用試劑的廠家很重要。建議您先用OXOID牌trypton和yeast extract，瓊脂Agar采用進口產(chǎn)品。

   具體操作如下：

   1）稱2g trypton、 1g yeast extract、1g NaCl和4g Agar加蒸餾水至198ml，15磅滅菌25分鐘。

   2）配20%葡萄糖20ml（國產(chǎn)分析純），8磅滅菌25分鐘。

   3）待上述兩種試劑冷卻下來，取2ml 20%葡萄糖加入LB固體培養(yǎng)基中，總計200ml，加氨芐到100-120μg/ml濃度，倒固體培養(yǎng)基約10個平板。

   4）上述平板放在室溫下放置24小時，以使表面變干。

   5）將上述克隆鑒定正確的帶目的基因的表達質(zhì)粒0.5μg-1μg轉(zhuǎn)達化相應受體菌感受態(tài)。

   6）1號、2號、3號、4號和8號重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli TOP 10F'進行表達，5號、6號、7號和9號重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL 21(DE3) plysS進行表達。

   7）轉(zhuǎn)化熱休克→冰浴后添加50μl-100μl soc培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基在搖床35^oC 150轉(zhuǎn)培養(yǎng)30分鐘涂布。涂布時添加5μl（濃度為1mg/ml）氨芐青霉素一并涂布，有利于表達。

表達培養(yǎng)基（固體）另一種配方為NZ-Amine加無機鹽加葡萄糖。這一配方不常用，但能更好地控制誘導前表達的問題。如您遇到對E.coli宿主毒性較大的基因如在普通LB平板上很難生長時，可采用這一配方（注意：一般不需要采用這一配方，LB配方就可以了）。

   具體操作如下：

（1）稱3.4g NZ-Amine(with MgSO₄+NaCl) 加4g進口瓊脂加蒸餾水至176ml，15磅滅菌25分鐘。即為基因表達培養(yǎng)基成份A。

（2）將2g NH₄Cl（無水計）、6g KH₂PO₄（無水計）和 6g Na₂HPO₄     （無水計）加蒸餾水至200ml，15磅滅菌25分鐘。即為基因表達培養(yǎng)基成份B母液。

（3）配20%葡萄糖20ml，8磅滅菌25分鐘。

（4）待上述三種試劑冷卻下來，取20ml基因表達培養(yǎng)基成份B母液和4ml 20%葡萄糖，添加至176ml的含2% 瓊脂的基因表達培養(yǎng)基成份A中，總計200ml，加氨芐至100-120mg/ml濃度，倒固體培養(yǎng)基約10個平板。

（5）上述平板放在室溫下放置24小時，以使表面變干。

（6）將上述克隆鑒定正確的帶目的基因的表達質(zhì)粒0.5-1mg轉(zhuǎn)化受體菌感受態(tài)。

（7）1號、2號、3號、4號和8號重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli Top 10F'進行表達，5號、6號、7號和9號重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL 21(DE3)plysS進行表達。

（8）轉(zhuǎn)化熱休克→冰浴后添加50μl-10μl SOC培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基在搖床35^oC 150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)30分鐘后涂布。涂布時添加5μl（濃度為1mg/ml）氨芐青霉素一并涂布，有利于是表達。

3、基因表達測定

液體培養(yǎng)基（LB配方）

每升    tryptone      10g

        yeast extract   5g

        NaCl        10g

加水至1升，調(diào)pH至7.2，15磅滅菌25分鐘

配制20%葡萄糖，8磅滅菌20分鐘，添加至上述LB中，終濃度為0.2%.

氨芐采用100mg/ml-120mg/ml工作濃度。

誘導劑IPTG母液    100mg/ml

1至3號質(zhì)粒表達測試方案（周質(zhì)空間分泌表達）

1)、將上述重組的1至3號質(zhì)粒轉(zhuǎn)化出單菌落挑至20ml LB培養(yǎng)基（+glucose 0.2% + Amp 120μg/ml，50ml三角瓶加8層紗布）于晚上9：30接種，100轉(zhuǎn)（不要太快），30^oC培養(yǎng)（不要37^oC），搖至第二天上午8：30。取8ml種子液加至200 ml液體LB（+glucose 0.2% + Amp 120μg/ml，1升三角瓶加8層紗布）35^oC 180轉(zhuǎn)快搖至OD₆₀₀為0.6左右，加IPTG至100μg/ml（IPTG濃度今后可以優(yōu)化），同時再補充一次新的Amp至120μg/ml（兩次共為240μg/ml），30^oC誘導3小時。

2)、離心收集菌體，用30mM Tris HCl、20%蔗糖1mM EDTA pH8.0(按每克菌體80ml計)懸浮后冰浴，輕輕振蕩10分鐘。

3)、8000g離心4^oC，去除上清，沉淀用5mM MgSO₄ 8ml懸浮后冰浴，輕輕振蕩10分鐘。

4)、12000g離心15分鐘，取上清即為cold  osmotic  shock  fluid.

5)、取3種重組質(zhì)粒和3種原質(zhì)粒的osmotic shock fluid樣品加SDS-PAGE上樣緩沖液，走電泳分析。如出現(xiàn)明顯的區(qū)帶且分子量與預計的一致即獲得了周質(zhì)空間分泌表達(MW ^{MBP with linker} =45KD)。

4至9號重組質(zhì)�；�因表達測試（胞內(nèi)表達）

由于4至9號重組質(zhì)粒均為胞內(nèi)表達，且表達量一般均大于20%，所以采用小樣20ml LB培養(yǎng)誘導即可將菌體離心走SDS-PAGE 電泳分析。

特別注意，由于本試劑盒5號、6號、7號和9號采用高拷貝數(shù)質(zhì)粒pUC18做母體，其一方面質(zhì)粒高拷貝數(shù)有利于高表達，但另一方面其表達分泌的β-內(nèi)酰胺酶也很高。而高濃度的β-內(nèi)酰胺酶水解LB平板上和LB液體里的氨芐。而一旦氨芐消耗掉了，E.coli BL 21(DE3) plysS很容易丟失重組質(zhì)粒，而不帶重組質(zhì)粒的E.coli 生長得更快從而比例會越來越多，這樣發(fā)酵過濃后表達會下降甚至很低。為此，您須仔細閱讀下面有關轉(zhuǎn)化和發(fā)酵的操作要求。（如您需要高密度發(fā)酵，建議您在本試劑盒篩選到合適表達方案后將表達元件從啟動子至轉(zhuǎn)錄終止子擴增克隆到帶卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒上，這樣可以克服氨芐易被水解的問題）。

具體操作如下：

（1）LB+Amp+glucose固體平板室溫下放置24hr后可以使用。

（2）一般上午10：00轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒5號、6號、7號和9號進E.coli BL21(DE3) plysS（注意：4號和8號尤其是8號一般較穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化平板放2-3天均可以做表達，但5號、6號、7號和9號須轉(zhuǎn)化后立即做表達）。

（3）晚上9：00接種，要求5號、6號、7號和9號轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3) plysS菌落較小（一般菌落越小，第二天表達量就越高）。4號和8號轉(zhuǎn)化E.coli TOP10F'，接種時對菌落大小要求不高。接種進20ml LB（+glucose 0.2% + Amp 120μg/ml,用50ml三角瓶加8層紗布，紗布通氣好，不要用棉花塞子）（特別注意，轉(zhuǎn)速要慢，否則菌體濃度過高，Amp水解了表達會下降）。

（4）70--90轉(zhuǎn)/分鐘30^oC培養(yǎng)過夜至第二天上午8：30 OD600約為0.5加IPTG 100μg/ml,150--170轉(zhuǎn)/分鐘37^oC誘導（5號、6號、7號和9號誘導1.5小時，4號和8號誘導3小時）。

（5）離心收集菌體走SDS-PAGE電泳分析。

（6）如出現(xiàn)明顯的區(qū)帶且分子量與預計的一致即獲得表達。(MW  ^{MBP with linker}=45KD, MW ^{GST with linker} =28.7KD,MW ^{CKS wih linker}=29.5KD,MW ^{TRX with linker}=14KD,MW DsbA with linker=24.7KD)。

4至9號重組質(zhì)粒表達產(chǎn)物可溶性分析:

通過小樣(20ml)表達測試后確認的表達菌株采用200ml搖瓶發(fā)酵確認表達產(chǎn)是否可溶。具體操作如下：

（1）按上述方法轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)20ml過夜種子液（注意嚴格按照上述方案進行，要注意5號、6號、7號和9號轉(zhuǎn)化E.coli BL 21(DE3) plysS菌落較小時接種，慢搖70--90轉(zhuǎn)/分鐘30^oC培養(yǎng)過夜）5ml種子液加至200ml LB（+glucose 0.2% + Amp 120μg/ml,用1000ml三角瓶加8層紗布）快搖35^oC 180轉(zhuǎn)/分2-3小時至OD₆₀₀=0.6時加IPTG 100μg/ml誘導（注意采用30^oC誘導，5號、6號、7號和9號誘導時間1.5小時即可，4號和8號誘導3小時）。

（2）用PBS約20ml懸浮菌體，超聲破碎，適當加少量溶菌酶。

（3）超聲液離心12000g，15分鐘，上清和沉淀走SDS－PAGE分析(MW  ^{MBP with linker}=45KD, MW ^{GST with linker} =28.7KD,MW ^{CKS wih linker}=29.5KD,MW ^{TRX with linker}=14KD,MW DsbA with linker=24.7KD)。上清有表達即為可溶部分。沉淀部分既可形成包涵體，也可以就是一般性沉淀。

發(fā)酵條件的優(yōu)化與菌株優(yōu)化：

１）一般發(fā)酵時低溫、低濃度誘導劑（ＩＰＴＧ）有利于表達分泌型、可溶型重組蛋白表達，但低溫時（一般分為２８^ｏＣ－３０^ｏＣ、２３^ｏＣ－２５^ｏＣ兩個區(qū)段）誘導時間可延長。

２）對宿主毒性較大的基因表達可加大氨芐的濃度（可達２００mｇ／ｍｌ）并提高培養(yǎng)基中葡萄糖濃度（可達0.5％）有利于穩(wěn)定表達。

３）一般發(fā)酵時溫度高、誘導劑濃度高有利于表達包涵體型重組蛋白。

４）進一步優(yōu)化成工程菌株的實驗以及中試放大試驗，凡購買本公司試劑盒的客戶，本公司予以指導。

基因表達產(chǎn)物的純化

通過上述組合篩選出的表達菌株發(fā)酵后純化目標蛋白。由于本系統(tǒng)采用了６Ｈｉｓ－ｔａｇ、ＧＳＴ和ＭＢＰ等親和配體，可快速純化出目標蛋白。凡購買本公司試劑盒的客戶，本公司予以協(xié)助。

四、載體資料

注意：表達載體表達功能區(qū)基因測序最終與本公司的DNA測序原始波形圖一致(來函備索)。

 五、相關產(chǎn)品

（1）重組3C protease

包裝量：1000 unit/支，其中每1000 unit 3C protease可以切割50mg融合蛋白

（2）基因工程下游蛋白純化試劑盒

本公司有GST、6His-tag、MBP等親合層析柱以及陽、陰離子交換、疏水層析和分子篩等蛋白純化試劑盒。

六、參考文獻

A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.

LaVallie ER, DiBlasio EA, Kovacic S, Grant KL, Schendel PF, McCoy JM.

Genetics Institute, Cambridge, MA 02140.

We have developed a versatile Escherichia coli expression system based on the use of E. coli thioredoxin (trxA) as a gene fusion partner. The broad utility of the system is illustrated by the production of a variety of mammalian cytokines and growth factors as thioredoxin fusion proteins. Although many of these cytokines previously have been produced in E. coli as insoluble aggregates or "inclusion bodies", we show here that as thioredoxin fusions they can be made in soluble forms that are biologically active. In general we find that linkage to thioredoxin dramatically increases the solubility of heterologous proteins synthesized in the E. coli cytoplasm, and that thioredoxin fusion proteins usually accumulate to high levels. Two additional properties of E. coli thioredoxin, its ability to be specifically released from the E. coli cytoplasm by osmotic shock or freeze/thaw treatments and its intrinsic thermal stability, are retained by some fusions and provide convenient purification steps. We also find that the active-site loop of E. coli thioredoxin can be used as a general site for small peptide insertions, allowing for the high level production of soluble peptides in the E. coli cytoplasm.

Expression of active human tissue-type plasminogen activator in Escherichia coli.

Qiu J, Swartz JR, Georgiou G.

Molecular Biology Program, University of Texas, Austin, Texas 78712, USA.

The formation of native disulfide bonds in complex eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli is extremely inefficient. Tissue plasminogen activator (tPA) is a very important thrombolytic agent with 17 disulfides, and despite numerous attempts, its expression in an active form in bacteria has not been reported. To achieve the production of active tPA in E. coli, we have investigated the effect of cooverexpressing native (DsbA and DsbC) or heterologous (rat and yeast protein disulfide isomerases) cysteine oxidoreductases in the bacterial periplasm. Coexpression of DsbC, an enzyme which catalyzes disulfide bond isomerization in the periplasm, was found to dramatically increase the formation of active tPA both in shake flasks and in fermentors. The active protein was purified with an overall yield of 25% by using three affinity steps with, in sequence, lysine-Sepharose, immobilized Erythrina caffra inhibitor, and Zn-Sepharose resins. After purification, approximately 180 microgram of tPA with a specific activity nearly identical to that of the authentic protein can be obtained per liter of culture in a high-cell-density fermentation. Thus, heterologous proteins as complex as tPA may be produced in an active form in bacteria in amounts suitable for structure-function studies. In addition, these results suggest the feasibility of commercial production of extremely complex proteins in E. coli without the need for in vitro refolding. 

Rapid screening for improved solubility of small human proteins produced as fusion proteins in Escherichia coli.

Hammarstrom M, Hellgren N, van Den Berg S, Berglund H, Hard T.

Department of Biotechnology, Royal Institute of Technology (KTH) Center for Physics, Astronomy and Biotechnology, S-106 91 Stockholm, Sweden.

A prerequisite for structural genomics and related projects is to standardize the process of gene overexpression and protein solubility screening to enable automation for higher throughput. We have tested a methodology to rapidly subclone a large number of human genes and screen these for expression and protein solubility in Escherichia coli. The methodology, which can be partly automated, was used to compare the effect of six different N-terminal fusion proteins and an N-terminal 6*His tag. As a realistic test set we selected 32 potentially interesting human proteins with unknown structures and sizes suitable for NMR studies. The genes were transferred from cDNA to expression vectors using subcloning by recombination. The subcloning yield was 100% for 27 (of 32) genes for which a PCR fragment of correct size could be obtained. Of these, 26 genes (96%) could be overexpressed at detectable levels and 23 (85%) are detected in the soluble fraction with at least one fusion tag. We find large differences in the effects of fusion protein or tag on expression and solubility. In short, four of seven fusions perform very well, and much better than the 6*His tag, but individual differences motivate the inclusion of several fusions in expression and solubility screening. We also conclude that our methodology and expression vectors can be used for screening of genes for structural studies, and that it should be possible to obtain a large fraction of all NMR-sized and nonmembrane human proteins as soluble fusion proteins in E. coli.

Expression of eukaryotic proteins in soluble form in Escherichia coli.

Zhang Y, Olsen DR, Nguyen KB, Olson PS, Rhodes ET, Mascarenhas D.

Department of Molecular and Cell Biology, Celtrix Pharmaceuticals, Inc., Santa Clara, California 95054, USA.

At the optimum temperature for its growth (37 degrees C), Escherichia coli tends to accumulate heterologous proteins in insoluble form. Fusion protein technology has been used to increase the solubility of overexpressed proteins in this organism, but with variable degrees of success. Fusion to a mutant form of DsbA (DsbAmut) confers higher levels of solubility to heterologous proteins in a reproducible way, even when E. coli is grown at 37 degrees C. We have shown this to be true with a diverse sample of eukaryotic proteins: IGF-I, IGFBP-3, 3C proteinase, TGF beta-2, sTGF beta-RII, BDNF, GDNF, mEGFBP, leptin, and GFP. In addition, we have investigated the effects of charge average and proline content on the solubility of DsbAmut fusions. Coexpression of a protein prolyl isomerase [cyclophilin (L-)] and modification of selected asparagine residues to aspartic acid appear to have beneficial effects on the accumulation of soluble heterologous proteins.

Efficient and rapid affinity purification of proteins using recombinant fusion proteases.
Walker PA, Leong LE, Ng PW, Tan SH, Waller S, Murphy D, Porter AG.
Protein Engineering Laboratory, National University of Singapore.
In the affinity purification of recombinant fusion proteins, the rate-limiting step is usually the efficient proteolytic cleavage and removal of the affinity tail and the protease from the purified recombinant protein. We have developed a rapid, convenient and efficient method of affinity purification which can overcome this limitation. In one example of the method, the protease 3C from a picornavirus (3Cpro), which cleaves specific sequences containing a minimum of 6-7 amino acids, has been expressed as a fusion with glutathione S-transferase. The resultant recombinant 'fusion protease' cleaves fusion proteins bearing (from the amino-terminus) the same affinity tail as the fusion protease, a 3Cpro cleavage recognition site, and the recombinant protein of interest. The recombinant protein is purified in a single chromatographic step which removes both the affinity tail and the fusion protease. The advantages over existing methods include much improved specificity of proteolytic cleavage, complete removal of the protease and the affinity tail in one step, and the option of adding any desired amount of fusion protease to ensure efficient cleavage. The potential flexibility of the method is shown by the use of various affinity tails and alternative fusion proteases.  

七、基因高效快速表達試劑盒質(zhì)量驗收標準

一、菌株 E.coli TOP10F¢基因型為：

Fˊ{lacI^q Tn10(Tet^R)} mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80 lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Str^R)endA1 nupG

E.coli BL21(DE3)plysS基因型為：

F^- ompT hsdS_B (r_B^-m_B^-)gal dcm(DE3)pLysS(Cam^R)

菌株要求：

（1）復蘇成活。

（2）無雜菌污染。

（3）抗性與基因型一致。

（4）LB平板菌落為大腸桿菌典型菌落。

（5）轉(zhuǎn)化帶氨芐抗性基因質(zhì)粒時負對照無菌落生長。

（6）轉(zhuǎn)化率大于10的六次方。

（7）8號質(zhì)粒pTrc-CKS轉(zhuǎn)化E.coli Top 10F'，IPTG誘導表達量大于30%（可溶）。

（8）9號質(zhì)粒pET-DsbA轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)plysS，IPTG誘導表達量大于30%（可溶）。

二、抗生素

四環(huán)素和氯霉素抗性檢驗可參照《中國藥典》進行。

三、表達載體

（1）所有載體均具氨芐抗性。

（2）表達載體大小與說明書一致。

（3）表達載體酶切位點與說明書一致。

（4）表達載體表達功能區(qū)基因測序與DNA測序原始波形圖一致(來函備索)。

（5）以Maltose binding protein基因為目標基因，所有九種載體均能表達，表達量從5%（分泌型）-40%（胞內(nèi)可溶）。

（6）質(zhì)粒無降解，確保轉(zhuǎn)化、酶切、連接等試驗成功。