試劑盒組成：

特別說明：

*: [96T/48T]（打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整）

#: 一周內使用可存于4℃，需長時間存放或多次使用建議存于-20℃.

相關試劑在分裝時會比標簽上標明的體積稍多一些，請在使用時量取而非直接倒出！

 

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心CLIA法。用抗人ACVA抗體包被于酶標板上，實驗時樣品或標準品中的人ACVA會與包被抗體結合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人ACVA抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素�？�人ACVA抗體與結合在包被抗體上的人ACVA結合、生物素與親和素特異性結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入發(fā)光底物混合液，發(fā)光底物在辣根過氧化物酶的催化下發(fā)出熒光，用化學發(fā)光免疫分析儀測定化學發(fā)光值（CL），人ACVA濃度與化學發(fā)光值之間呈正相關，通過繪制標準曲線計算出樣品中人ACVA的濃度。

 

 

樣品收集:

1.       血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。

2.       血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。

3.       組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.       細胞培養(yǎng)上清：取細胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。

5.       其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測

具體處理方法可參考：http://www.elabscience.cn/index.php/resources/view/aid/17671.jsp

6.       樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。

7.       樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內檢測)，或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融。

8.       如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品最高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋（建議先做預實驗，以確定稀釋倍數）。

 

試驗所需自備物品:

1.       化學發(fā)光免疫分析儀

2.       高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.       37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

4.       吸水紙

 

檢測前準備工作:

1.         請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2.         將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現象，可用40℃水浴微加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應為室溫）。當日使用。

3.         標準品: 加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，靜置10分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻（濃度為5000pg/mL）。然后根據需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、0ng/mL，標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔0pg/mL。如配制2500pg/mL標準品：取0.5mL5000pg/mL的上述標準品加入含有0.5mL標準品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。

4.         生物素化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當日使用。

5.        酶結合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。當日使用。

6.        發(fā)光底物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，將發(fā)光底物A液和B液等體積混合。當日使用。

 

洗滌方法:

1.         自動洗板機：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。

2.         手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干。

 

操作步驟:

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1.     加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔�？瞻卓准訕藴势�&樣品稀釋液100μL，余孔分別加標準品或待測樣品100μL，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育90分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.     棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液100μL（在使用前15分鐘內配制），酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時。

3.     棄去孔內液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。

4.     每孔加酶結合物工作液（臨用前15分鐘內配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育30分鐘。

5.     棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。

6.     每孔加混合好的發(fā)光底物工作液100μL，酶標板加上覆膜37℃避光孵育5分鐘。

7.     立即用化學發(fā)光免疫分析儀測定各孔的化學發(fā)光值。應提前打開化學發(fā)光免疫分析儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。

8.     實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。

 

注意事項：

1.       保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會出現錯誤的結果。

2.       酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質，此為正�，F象，不會對實驗結果造成任何影響。暫時不用的板條應拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！

3.       加樣：加樣或加試劑時，第一個孔與最后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。每次的加樣時間最好控制在10分鐘內。推薦設置復孔。

4.       溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時必須給酶標板覆膜；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標板處于干燥狀態(tài)；嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

5.       洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。

6.       試劑配制：Concentrated BiotinylatedDetection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較小，運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用前1000轉/分離心1min，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標準品、生物素化抗體工作液、酶結合物工作液請根據所需用量配制，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請精確配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated BiotinylatedDetection Ab時，一次不要小于10μL），以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素化抗體工作液、酶結合物工作液。若需要分次使用標準品應按照每一次用量分裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復凍融。

7.       底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

8.       混勻：充分輕微混勻對反應結果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。

9.       安全：試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品時，請按國家生物試驗室安全防護條例執(zhí)行。

10.   不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液除外）

11.   試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴禁混用，否則將影響試驗結果！