動物細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶活性化學發(fā)光法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

 

主要用途

 

動物細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶活性化學發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在使用化學方法，快速有效地裂解動物細胞，通過高速離心，獲得澄清細胞裂解懸液，在β-半乳糖苷酶反應體系里，以人工合成的二惡二酮類化合物作為發(fā)光底物，水解所產生的發(fā)光產物，通過發(fā)光探測儀（Luminometer）測定其相對冷光單位（RLU）的變化，以此進行測算細胞裂解懸液制備樣品中的低表達β-半乳糖苷酶活性，藉此評價作為細胞復制性衰老（replicative senescence）的分子特征來探測衰老狀況的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。廣泛應用于基因組學、蛋白質組學和其它分子生物學研究。廣泛應用于細胞生物學研究。其適用于各種人體和動物細胞裂解懸液等樣品衰老細胞內源性半乳糖苷酶活性分析。產品即到即用，性能穩(wěn)定，參數優(yōu)化，操作簡便、高度敏感。

 

技術背景

 

細胞復制性衰老是細胞控制其生長潛能的保障機制。衰老細胞停滯在細胞周期的G1期，表現出細胞扁平、脹大、顆粒增多的形態(tài)特征，尤其在酸性條件下，細胞內β-半乳糖苷酶活性增加，而成為細胞衰老的生物學標記。甲氧基二惡二酮氯代金剛烷苯基吡喃半乳糖苷（3- (4-methoxyspiro [1, 2-dioxetane-3, 2'- (5'-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7]-decan]-4-yl-phenyl -ß-D-galacto pyranoside），是一種二惡二酮（dioxetane）類發(fā)光底物，以替代乳糖，在β-半乳糖苷酶的催化下，去糖基化后，產生二惡二酮，進而在多聚苯甲基乙烷乙烯基苯甲氯化銨和熒光素鈉（poly (benzyldimethylvinylbenzyl) ammonium chloride and sodium fluorescein）的啟動反應作用下，同時pH調整到12，由此二惡二酮分解，發(fā)出冷光，在冷光儀（475nm波長）下，檢測發(fā)光信號，來測定β-半乳糖苷酶的活性。其發(fā)光產物半衰期為10分鐘，檢測敏感度可達20飛克（fg）。

 

產品內容

 

清理液（Reagent A）     120毫升

裂解液（Reagent B）    10毫升

稀釋液（Reagent C）   600微升

反應液（Reagent D）    12微升

堿性液（Reagent E）   2.5毫升

啟動液（Reagent F）   220微升

陰性液（Reagent G）    1毫升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、反應液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；反應液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）避免光照；堿性液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

 

用戶自備

 

β-半乳糖苷酶標準樣（GMS60003.2.2）：用于建立β-半乳糖苷酶標準曲線

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

黑色96孔板：用于冷光檢測操作的容器

恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于反應物孵育

冷光儀：用于樣品冷光檢測

 

實驗步驟

 

實驗開始前，開啟化學發(fā)光儀預熱，設置波長475nm；開啟恒溫水槽，設置溫度為37℃。同時從－20℃冰箱里取出裂解液（Reagent B）和反應液（Reagent D）等置于冰槽里融化；反應液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）避免光照。然后進行下列操作：

 

• 樣品準備

 

• 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測定準備

 

• 從-70℃取出上述制備的待測樣品，置于冰槽里 
• 反應液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）嚴格注意避光
• 設定好化學發(fā)光儀：溫度為30℃預熱和運行程序（清洗步驟等）：整合5秒，并置零 
• 然后關掉實驗室的燈光

 

• 活性檢測

 

檢測開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化；然后移出100微升稀釋液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管，加入1微升反應液（Reagent D），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為反應工作液，放在暗室里。同時移出200微升堿性液（Reagent E）到另一新的1.5毫升離心管，加入20微升啟動液（Reagent F），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為啟動工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。

 

• 準備1個黑色96孔板，并做好標記：包括背景對照和待測樣品
• 分別加入50微升反應工作液到所有測試孔里
• 加入5微升陰性液（Reagent G）到背景對照孔里
• 加入5微升待測樣品（50微克細胞裂解懸液蛋白）到待測樣品孔里
• 輕輕搖動酶標板，混勻
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 分別加入100微升啟動工作液到所有測試孔里
• 輕輕搖動96孔板，混勻
• 室溫下靜置10秒，嚴格避免光照
• 即刻放進冷光儀檢測：5秒整合檢測
• 獲得相對發(fā)光單位（Relative Light Unit；RLU）

 

• 樣品活性分析

 

1．計算公式

RLU_樣品活性－RLU_背景對照＝RLU_{樣品實際活性}

 

2．繪制RLU讀數（Y軸）和時間（X軸）關系曲線

 

五、樣品β-半乳糖苷酶實際活性單位計算（建議使用 β-半乳糖苷酶標準曲線化學發(fā)光法測定試劑盒－GMS10419.2）

 

• 構建β-半乳糖苷酶標準曲線：橫座標（x軸）為每毫升β-半乳糖苷酶單位濃度；縱坐標（y軸）為標準樣品讀數（吸光單位OD值）
• 根據β-半乳糖苷酶標準曲線，測算樣品中含有β-半乳糖苷酶的活性單位（單位/毫克樣品）

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作
• 本產品的各項參數達到最優(yōu)化
• 操作時，須戴手套
• 反應液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）具有光高度敏感性，因此整個操作須避光進行，避免反復凍融
• 測讀的所有步驟均須在暗室里進行
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 用戶可以測定細胞裂解懸液的蛋白濃度，便于計算活性單位之需；建議使用 Bradford蛋白質濃度定量檢測試劑盒（GMS30030.1）
• 加入啟動工作液10秒后，即刻進行冷光測定
• 如果用戶沒有冷光儀，可以使用閃爍探測器（scitillation counter 或β計數器）替代，但敏感性較低
• 如果是注射式冷光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗冷光儀注射（injector）管道
• 相對發(fā)光讀數RLU（Relative Light Unit）越高，表明酶活性越高
• 測定后，專用測定杯須清洗徹底
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量 
• 用戶可以使用β-半乳糖苷酶構建標準曲線，進行樣品酶活性單位檢測或使用 β-半乳糖苷酶標準曲線化學發(fā)光法測定試劑盒－GMS10419.2
• 本公司提供系列β-半乳糖苷酶檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經鑒定檢測敏感

上海一基實業(yè)有限公司多年專供：ELISA試劑盒，PCR恒溫熒光測試盒、朗道校準品、校準質控品、標準品|對照品、抗體|抗原、生物試劑、動物血清、人類CDNA、基因組DNA、MicroRNA產品、總RNA產品、人原代細胞裂解液、生物試劑、高端試劑等系列產品。如需產品詳細說明等物理性質信息請聯(lián)系客服為您查詢！質量保證，價格優(yōu)惠，是國內生物試劑權威的供應商之一，專業(yè)經銷生物科學領域的品牌試劑：Sigma試劑、ASROS試劑、AIFA試劑、alding試劑、Fisher試劑、日本MBL試劑、美國劍橋CIL氘代試劑、ATCC菌株等品牌產品。擁有齊全的生產和檢測設備，實施嚴格的管理制度和完善的質量保證體系，為廣大客戶提供全面的技術支持和完善的售后服務。歡迎來電咨詢!