植物細(xì)胞周期S期同步（SYNCHRONY）處理試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

植物細(xì)胞周期S期同步（SYNCHRONY）處理試劑是一種旨在使用蔗糖缺陷和羥基脲雙重處理，誘導(dǎo)活體細(xì)胞樣品同步處于細(xì)胞周期S期狀態(tài)的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種代表性植物懸浮細(xì)胞（例如擬南芥MM1、MM2d、煙草細(xì)胞BY-2等）以及轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的細(xì)胞周期S期同步化處理。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，作用顯著。

 

技術(shù)背景

 

細(xì)胞周期同步化（cell cycle synchrony）是通過外在的化學(xué)處理，使所有或絕大部分細(xì)胞處于同一細(xì)胞生長周期的特定階段（G0、G1、S、G2、M等），同步實(shí)施相同的生化代謝活動，便于創(chuàng)造參數(shù)可控、目標(biāo)明確的研究條件，來發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性或外源性因子產(chǎn)生的細(xì)胞變化的關(guān)聯(lián)性，確定細(xì)胞周期特異性基因表達(dá)和分子分布，以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)狀況，例如成膜體（phragmoplast）等。快速生長的植物細(xì)胞的細(xì)胞周期分為4個(gè)周期：G1（growth 1；生長期1；4至8小時(shí)）、S（synthesis；DNA復(fù)制；5小時(shí)）、G2（growth 2；生長期2；2至4小時(shí)）、M（mitosis；細(xì)胞有絲分裂；2至3小時(shí)）期。細(xì)胞周期依賴性激酶（cyclin dependent kinase；CDK）復(fù)合體調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入不同周期。通過使用不同的抑制劑達(dá)到特定周期的阻滯與釋放（arrest and release），直至所有細(xì)胞同步。S期同步處理方法是通過蔗糖缺陷和羥基脲（hydroxyurea）雙重處理后，抑制核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase）活性，從而阻止核糖核苷酸（dNTPs）合成，達(dá)到抑制DNA合成，致細(xì)胞周期阻滯，使細(xì)胞誘導(dǎo)處于S期。

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）     2 X 500毫升

處理液（Reagent B）          2 毫升

產(chǎn)品說明書           1份

 

 

 

保存方式

 

保存處理液（Reagent B）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶自備

 

 Murashige & Skoog基礎(chǔ)培養(yǎng)基（12323）：用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)基

50毫升錐形離心管：用于培養(yǎng)細(xì)胞的容器

恒溫?fù)u床：用于細(xì)胞孵育

20微米尼龍網(wǎng)：用于清洗

小型漏斗：用于清洗的裝置

4℃臺式離心機(jī)：用于樣品操作

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 準(zhǔn)備1管20毫升的植物懸浮細(xì)胞
• 轉(zhuǎn)移到50毫升錐形離心管
• 使用MS（Murashige and Skoog medium）完全培養(yǎng)基（MS+蔗糖、二氯苯氧乙酸（2,4-Dichlorophenoxyaceticacid；2,4-D）、呋喃甲基腺嘌呤（kinetin）
• 放進(jìn)27℃搖床孵育7天，速度為130RPM（注意：根據(jù)細(xì)胞特點(diǎn)，采取光照或暗室）
• 準(zhǔn)備1個(gè)小型漏斗，內(nèi)襯20微米尼龍網(wǎng)，置于50毫升錐形離心管上
• 將所有細(xì)胞內(nèi)容液移入到小型漏斗里過濾
• 加入20毫升清理液（Reagent A），清洗過濾5分鐘
• 重復(fù)加入20毫升清理液（Reagent A），清洗過濾5分鐘
• 轉(zhuǎn)移細(xì)胞到新的50毫升錐形離心管
• 加入20毫升清理液（Reagent A），混勻
• （替代過濾步驟5至10）放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為400g（注意：如果細(xì)胞難以沉淀，可以增加到3000g）
• （替代過濾步驟5至10）小心抽去上清液
• （替代過濾步驟5至10）加入20毫升清理液（Reagent A），混勻
• （替代過濾步驟5至10）放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為400g（注意：如果細(xì)胞難以沉淀，可以增加到3000g）
• （替代過濾步驟5至10）小心抽去上清液
• （替代過濾步驟5至10）重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟13至15一次
• （替代過濾步驟5至10）加入20毫升清理液（Reagent A），混勻
• 移取4毫升懸浮細(xì)胞到新的50毫升錐形離心管
• 加入16毫升新鮮的清理液（Reagent A）
• 放進(jìn)27℃搖床孵育24小時(shí)，速度為130RPM（注意：根據(jù)細(xì)胞特點(diǎn)，采取光照或暗室）
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為400g（注意：如果細(xì)胞難以沉淀，可以增加到3000g）
• 小心抽去上清液
• 加入20毫升用戶自備的MS完全培養(yǎng)液
• 放進(jìn)27℃搖床孵育1小時(shí)，速度為130RPM（注意：根據(jù)細(xì)胞特點(diǎn)，采取光照或暗室）
• 移取4毫升懸浮細(xì)胞到新的50毫升錐形離心管
• 加入16毫升新鮮的MS（Murashige and Skoog medium）完全培養(yǎng)基
• 加入200微升處理液（Reagent B）
• 放進(jìn)27℃搖床孵育18小時(shí)，速度為130RPM（注意：根據(jù)細(xì)胞特點(diǎn)，采取光照或暗室）
• 準(zhǔn)備1個(gè)小型漏斗，內(nèi)襯20微米尼龍網(wǎng)，置于50毫升錐形離心管上
• 將所有細(xì)胞內(nèi)容液移入到小型漏斗里過濾
• 加入20毫升用戶自備的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，清洗過濾5分鐘
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟31四次
• 轉(zhuǎn)移細(xì)胞到新的50毫升錐形離心管
• （替代過濾步驟29至33）放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為400g（注意：如果細(xì)胞難以沉淀，可以增加到3000g）
• （替代過濾步驟29至33）小心抽去上清液
• （替代過濾步驟29至33）加入20毫升用戶自備的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混勻
• （替代過濾步驟29至33）放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為400g（注意：如果細(xì)胞難以沉淀，可以增加到3000g）
• （替代過濾步驟29至33）小心抽去上清液
• （替代過濾步驟29至33）重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟36至38四次
• 加入20毫升用戶自備的MS完全培養(yǎng)液
• 放進(jìn)27℃搖床孵育2小時(shí)，速度為130RPM――細(xì)胞進(jìn)入S期
• 繼續(xù)后續(xù)操作，包括細(xì)胞流式儀鑒定（注意：建議使用植物細(xì)胞流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期紅色熒光分析試劑盒――10405）

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為10次操作
• 本產(chǎn)品適用于快速生長（倍增時(shí)間24小時(shí)內(nèi)），且分散充分的植物懸浮細(xì)胞
• 擬南芥PSB-D、T87，以及其它植物懸浮細(xì)胞均可使用
• 本產(chǎn)品可以達(dá)到80%細(xì)胞以上同步出現(xiàn)S期
• 操作時(shí)，須戴手套
• 操作時(shí)，須嚴(yán)格無菌操作
• 用戶可以根據(jù)需求，使用不同的細(xì)胞用量，相應(yīng)調(diào)整試劑用量
• 用戶可以根據(jù)不同細(xì)胞類型，采取光照或暗室培養(yǎng)
• 建議使用過濾清洗為優(yōu)選
• 通常情況下，同步化處理后的細(xì)胞周期和時(shí)間關(guān)系參考如下

 

處理后時(shí)間	細(xì)胞周期階段	特征
2至6小時(shí)	S	80%
7至8小時(shí)	G2
9至12小時(shí)	M

 

• 本公司提供系列細(xì)胞周期分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無細(xì)菌、病毒和支原體污染

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