動(dòng)物血小板高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

YIJI動(dòng)物血小板高質(zhì)純化線粒體分離試劑是一種旨在通過(guò)低速差速離心和化學(xué)滲壓休克處理來(lái)純化血小板、以及物理或化學(xué)破膜和等密度離心的方法，直接從動(dòng)物血細(xì)胞中分離出活性完整而高度純化的血小板線粒體細(xì)胞器的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于人體和各種動(dòng)物全血（鼠、豬、羊等）中血小板活性線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，活性保證，純度可達(dá)99％。可以被用于線粒體酶活性、細(xì)胞凋亡、衰老、信號(hào)傳遞、能量代謝、蛋白組學(xué)和古生物學(xué)、病理生理學(xué)（神經(jīng)病變或腫瘤）等的研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度保證。

 

技術(shù)背景

 

線粒體細(xì)胞器的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的最常用的手段之一。從任何組織或細(xì)胞分離線粒體的技術(shù)方法基本上采用：第一，通過(guò)機(jī)械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞；第二，通過(guò)低速差速離心去除殘?jiān)�碎屑和巨大�?xì)胞器；第三，通過(guò)高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過(guò)等密度離心獲得純度更高的線粒體。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI清理液（Reagent A）   250毫升

YIJI裂解液（Reagent B）    40毫升

YIJI凈化液（Reagent C）    10毫升

YIJI強(qiáng)化液（Reagent D）     5毫升

YIJI保存液（Reagent E）   100毫升

YIJI活性液（Reagent F）   200微升

YIJI高純液（Reagent G）    55毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份

 

保存方式

 

保存YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI高純液（Reagent G），避免光照；YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent E）嚴(yán)格無(wú)菌操作；有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

4℃超速離心機(jī)：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

超聲儀：用于裂解細(xì)胞

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 物理處理法

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的YIJI活性液（Reagent F）凍融，然后移出20微升YIJI活性液（Reagent F）和 1毫升YIJI凈化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為YIJI裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備1個(gè)無(wú)菌的50毫升錐形離心管
• 輕輕混勻10至20毫升新鮮（2小時(shí)內(nèi)抽取的靜脈血）的抗凝全血樣品
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動(dòng)的細(xì)胞顆粒群
• 用手指輕彈離心管2至3下，使細(xì)胞顆粒群松動(dòng)
• 加入10毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動(dòng)的細(xì)胞顆粒群（扔掉含有細(xì)胞顆粒群的離心管）
• 放入含有上清液的離心管到臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動(dòng)的細(xì)胞顆粒群（扔掉含有細(xì)胞顆粒群的離心管）――此步驟獲得血小板富集血清
• 放入含有上清液的離心管到臺(tái)式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽掉上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放入臺(tái)式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暫時(shí)停止操作，須暫時(shí)放進(jìn)－70℃冰箱里）――此步驟獲得純化的血小板
• 加入5毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約10下）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)11）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）置于超聲儀槍頭下，離心管在冰槽里
• （選擇步驟）超聲功率為60％（或150赫茲）猝擊10秒，間隙30秒，10個(gè)循環(huán)
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻沉淀顆粒
• 放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取5.5毫升的YIJI高純液（Reagent G）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液(Reagent G)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在YIJI高純液（Reagent G）的上面，避免震動(dòng)
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見(jiàn)下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號(hào)針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent E）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟35至38一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

 

• 化學(xué)處理法

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的YIJI活性液（Reagent F）凍融，然后移出20微升YIJI活性液（Reagent F）和 1毫升YIJI凈化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為YIJI裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備1個(gè)無(wú)菌的50毫升錐形離心管
• 輕輕混勻10至20毫升新鮮（2小時(shí)內(nèi)抽取的靜脈血）的抗凝全血樣品
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動(dòng)的細(xì)胞顆粒群
• 用手指輕彈離心管2至3下，使細(xì)胞顆粒群松動(dòng)
• 加入10毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動(dòng)的細(xì)胞顆粒群（扔掉含有細(xì)胞顆粒群的離心管）
• 放入含有上清液的離心管到臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動(dòng)的細(xì)胞顆粒群（扔掉含有細(xì)胞顆粒群的離心管）――此步驟獲得血小板富集血清
• 放入含有上清液的離心管到臺(tái)式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽掉上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放入臺(tái)式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暫時(shí)停止操作，須暫時(shí)放進(jìn)－70℃冰箱里）――此步驟獲得純化的血小板
• 入5毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入500微升預(yù)冷的YIJI強(qiáng)化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)11）
• 加入5毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻沉淀顆粒
• 放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取5.5毫升的YIJI高純液（Reagent G）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液(Reagent G)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在YIJI高純液（Reagent G）的上面，避免震動(dòng)
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見(jiàn)下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號(hào)針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent E）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟36至38一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為10次（10至20毫升全血/次）操作
• 其它實(shí)際操作的全血容量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如40毫升全血，試劑用量加倍
• 操作時(shí)，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent E）
• 操作時(shí)，須戴手套
• 建議使用新鮮全血：2小時(shí)內(nèi)的全血為理想狀態(tài)，不要超過(guò)24小時(shí)
• 全血樣品采集須使用EDTA二鉀血液抗凝液（GMS12059.1）、ACD血液抗凝液（GMS12059.4），或肝素鈉血液抗凝液（GMS12059.5）
• 建議使用足夠的樣品量
• 血小板提取量因人而異；如果不足，建議增加全血量
• 線粒體操作均須在4℃或以下?tīng)顟B(tài)下進(jìn)行
• 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
• 物理處理法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理

12． 本產(chǎn)品所獲得的線粒體純度（可達(dá)到99％）和產(chǎn)量最為理想

13． 使用YIJI高純液（Reagent G）前，須搖勻后加入；并注意避免污染母液

• 根據(jù)超速離心管的大小調(diào)整YIJI高純液（Reagent G）的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿
• 每毫升全血平均可獲得2 X 10⁸血小板
• 通常10毫升全血的血小板線粒體含量為10至25微克線粒體蛋白

17． 如果需要計(jì)量線粒體，稀釋后數(shù)分鐘內(nèi)完成，否則線粒體將分解

• 線粒體正常活性測(cè)定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細(xì)胞色素吸收峰譜等
• 線粒體內(nèi)外膜完整測(cè)定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色
• 本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等
• 本公司提供系列線粒體試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體內(nèi)外膜完整
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體維持正�；钚�
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶

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