HEPES緩沖鹽溶液(2×HeBS,pH6.7)
產品簡介:
外源基因導入真核細胞的方法有很多種,如磷酸鈣轉染法、DEAE-葡聚糖轉染法、脂質體法、電穿孔法、顯微注射法等。2×HEPES緩沖鹽溶液主要用于磷酸鈣轉染,其主要成分HEPES,HEPES是一種非離子兩性緩沖劑,能有效控制pH在6.8~8.2范圍,尤其在pH7.2~7.4具有較好的緩沖能力,終濃度一般為10~50mmol/L,培養(yǎng)液內含20mmol/L HEPES即可達到較好的緩沖能力。
HEPES緩沖鹽溶液(2×HeBS)是一種常用的細胞轉染溶液,主要由HEPES、氯化鈉、磷酸鹽等組成,其最適合pH值為6.7,經過濾除菌處理。影響磷酸鈣轉染效率的因素主要有沉淀中DNA含量、DNA在細胞上停留的時間、休克時間。2×HeBS要求DNA濃度在10~50μg為宜,Hela、BALB等細胞沉淀放置16h,CHO、DUKX、BⅡ等細胞可以通赤甘油、DMSO進行熱休克處理以提高轉染效率。
自備材料:
1、 胰蛋白酶消化液
2、 PBS
3、 無菌水
4、 CaCl2溶液
5、 甘油或DMSO
6、 篩選藥物
操作步驟(僅供參考):
1、 在轉染前24h用蛋白酶消化培養(yǎng)細胞,取適量數期細胞轉移至新的培養(yǎng)器皿中,使細胞在轉染時生長狀態(tài)良好。
2、 在加入DNA之前2~4h,按9ml/10cm培養(yǎng)皿的比例加入完全培養(yǎng)液,置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
3、 取適量乙醇沉淀的DNA溶解于450μl無菌水中,加入50μl 2.5M CaCl2并充分混勻,使Ca2+終濃度達到0.25M。
4、 用移液器一邊吹打2×HeBS,一邊逐滴加入配制好的DNA/CaCl2溶液(操作應迅速,一般在30~60s),并劇烈振蕩5s,室溫下靜置20~30min以形成沉淀。
5、 取沉淀均勻加入到培養(yǎng)皿細胞中,輕輕晃動使沉淀于培養(yǎng)液充分混勻,置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~16h。如果培養(yǎng)細胞為CHO、DUKX等,可以DMSO或甘油進行休克處理,轉染效率會大大增加。即培養(yǎng)4~6h后,用2ml含10%甘油或20%DMSO的完全培養(yǎng)液替換當前培養(yǎng)液,室溫下靜置3min,加5ml PBS搖動混勻。
6、 去除培養(yǎng)液,用PBS清洗細胞2次,加入5~10ml完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
7、 對于瞬時轉染,在轉染的不同時間點內收集細胞并檢測,一般時間多控制在12~60h以內。
8、 對于穩(wěn)定轉染,轉染后在非選擇性培養(yǎng)液培養(yǎng)18~48h,一般時間多控制在24~36h,以便外源基因表達。
9、 用胰蛋白酶消化細胞并傳代,更換適當的選擇培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng),沒2~4d更換一次選擇培養(yǎng)液,一般10~14d會出現目的細胞克隆。
注意事項:
1、 注意無菌操作,盡量避免污染。
2、 對于瞬時轉染,可以不用乙醇沉淀的DNA。
3、 休克處理某些細胞系會使轉染效率大大提高,但應注意甘油暴露過久易導致細胞死亡。
4、 轉染12~24h后,可以加入終濃度為10mmol/L的丁酸鈉溶液,可以提高病毒滴度。
5、 該試劑用于轉染時應檢測其轉染效率,好的轉染效率應介于30~60%之間。
6、 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。