產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱：人肺類器官分化試劑盒
貨號(hào)：RC200130
批號(hào)：見(jiàn)包裝
試劑清單：

序號(hào)	名稱	數(shù)量	貨號(hào)	存儲(chǔ)
1	S1完全培養(yǎng)基	50 ml ×1	RC200130-1	-20至-80   ℃
2	S2完全培養(yǎng)基	100 ml ×2	RC200130-2	-20至-80 ℃
3	S3完全培養(yǎng)基	100 ml ×3	RC200130-3	-20至-80   ℃
4	基礎(chǔ)培養(yǎng)基	100 ml ×1	RC200130-4	2-8   ℃

存儲(chǔ)與有效期：
組分1、2、3于-20至-80 ℃避光保存，組分4于2-8 ℃避光保存。組分1、2、3必須避免反復(fù)凍融；首次完全解凍后可以按使用量進(jìn)行分裝，置于-20至-80 ℃長(zhǎng)期保存；2-8 ℃條件下，穩(wěn)定儲(chǔ)存2周。
適用范圍：
本試劑盒適用于人定型內(nèi)胚層細(xì)胞（SOX17+/FOXA2+細(xì)胞，詳見(jiàn)本公司定型內(nèi)胚層高效分化試劑盒，RC200123）進(jìn)一步定向肺系細(xì)胞分化，同時(shí)進(jìn)行立體培養(yǎng)，形成肺類器官。
產(chǎn)品介紹
類器官與懸浮培養(yǎng)是當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用的前沿，是未來(lái)再生醫(yī)學(xué)與組織工程發(fā)展的趨勢(shì)。為適應(yīng)日益發(fā)展的科研需求，并為生命科學(xué)尤其是再生醫(yī)學(xué)研究的需要，開(kāi)發(fā)優(yōu)化了相關(guān)產(chǎn)品，可以為科研工作者提供穩(wěn)定的研究平臺(tái)，以助力研究的時(shí)效性和經(jīng)濟(jì)性。該產(chǎn)品設(shè)計(jì)同時(shí)考慮再生醫(yī)學(xué)臨床前研究的需求，可以為研究人員提供大量穩(wěn)定的種子細(xì)胞，加速應(yīng)用后期技術(shù)的研發(fā)。
本產(chǎn)品無(wú)血清、成分明確、含有細(xì)胞保護(hù)因子，適合于人多能干細(xì)胞分化為定型內(nèi)胚層細(xì)胞之后進(jìn)一步肺類器官的誘導(dǎo)。
操作方法
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

• 完全培養(yǎng)基準(zhǔn)備：
• 1-3（S1、S2、S3）均為完全培養(yǎng)基：2-8℃解凍。完全融化后輕輕搖勻，可以按照實(shí)際使用量分裝。分裝后立即存儲(chǔ)于-20至-80 ℃，避免反復(fù)凍融。
• 2-8℃冰箱過(guò)夜，切不可置于37℃水浴劇烈解凍，解凍后請(qǐng)務(wù)必充分混勻，以保證培養(yǎng)基成分的均勻度。
• 自備試劑耗材：
  • 多能干細(xì)胞完全培養(yǎng)基
  • 定型內(nèi)胚層高效分化試劑盒（RC200123）
  • 基質(zhì)膠
  • 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)板
  • 細(xì)胞固定液（2-4%中性多聚甲醛）

操作方法

1. S1階段：人多能干細(xì)胞提前分化為定型內(nèi)胚層細(xì)胞 （建議分化效率大于80%，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SOX17+/FOXA2+細(xì)胞），棄去培養(yǎng)基，用適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基（RC200130-4），培養(yǎng)基加入量約2 ml/孔（六孔板），輕柔洗2次。棄去培養(yǎng)基，輕柔加入S1完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加入量約2 ml/孔（六孔板），每天換液，連續(xù)5天。
2. 該試劑盒從定型內(nèi)胚層細(xì)胞起始，定型內(nèi)胚層細(xì)胞誘導(dǎo)方法見(jiàn)定型內(nèi)胚層高效分化試劑盒，RC200123。定型內(nèi)胚層細(xì)胞狀態(tài)對(duì)肺類器官誘導(dǎo)成敗十分關(guān)鍵，需特別注意。
3. 以上操作方案以六孔板為例，若使用其他器皿可以根據(jù)需要自行調(diào)整方案。調(diào)整方案時(shí)建議以細(xì)胞密度為穩(wěn)定因素。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2、飽和濕度。所有培養(yǎng)基在使用前必須進(jìn)行室溫復(fù)溫。這些注意事項(xiàng)同樣適用于以下步驟。
   1. S2階段：S1階段5天誘導(dǎo)結(jié)束后，提前準(zhǔn)備好立體培養(yǎng)用基質(zhì)膠（推薦BD Biosciences公司，貨號(hào)356237，以下簡(jiǎn)稱3D膠）。S1細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基洗2次，加入適量的消化液（RegenTASE，RC200111或ACCUTASE；6孔板每孔700 μl左右，消化液覆蓋細(xì)胞即可），置于37℃培養(yǎng)箱中消化3-6 分鐘。每2分鐘置于倒置顯微鏡下觀察，待克隆邊緣發(fā)亮?xí)r即輕柔吸棄消化液。加入適量的S2完全培養(yǎng)基輕柔吹打細(xì)胞數(shù)次，將細(xì)胞懸液移至1.5 ml EP管中，200-300 g離心5分鐘。棄上清（20 μl槍頭進(jìn)一步吸棄上清，過(guò)多上清殘留會(huì)影響立體培養(yǎng)），輕輕振蕩使細(xì)胞團(tuán)塊散開(kāi)，置于冰上2-3分鐘。取100 μl提前準(zhǔn)備好的3D膠（冰上）加入細(xì)胞，輕柔吹打，使細(xì)胞分布均勻，切勿產(chǎn)生大量氣泡。按20 μl左右每滴分散滴入六孔板，推薦每孔滴6滴左右，置于37℃培養(yǎng)箱中20分鐘左右使3D膠固化，固化后加入3-5 ml的S2完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液一次，每4-6天傳代一次。S2階段共12天。
4. 試劑準(zhǔn)備，BD Biosciences公司貨號(hào)356237的3D膠使用方法，須將3D膠置于冰上融化，分裝后保存于-80℃，避免反復(fù)凍融。使用時(shí)，提前按置于冰上過(guò)夜融化備用。
5. 為了降低消化過(guò)程對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響，建議在消化液中加入10 μM的 Y-27632。
6. 移液槍吹打細(xì)胞時(shí)務(wù)必輕柔，切不可產(chǎn)生大量氣泡，本試劑盒全程均需注意此問(wèn)題。
   1. 傳代方法：用無(wú)菌巴氏吸管將立體培養(yǎng)的類器官（含3D膠）刮下并轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，用1 ml槍頭機(jī)械吹散膠體， 200-300 g離心5分鐘。棄上清（20 μl小槍頭進(jìn)一步吸棄上清，過(guò)多上清殘留會(huì)影響立體培養(yǎng)），置于冰上2-3分鐘。取100-200 μl左右提前準(zhǔn)備好的3D膠（冰上）加入細(xì)胞，并輕柔吹打，使細(xì)胞分布均勻，按20 μl左右每滴分散滴入六孔板，推薦每孔滴6滴左右，置于37℃培養(yǎng)箱中20分鐘左右，使3D膠固化，固化后加入3-5 ml S2完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
7.  傳代比例1：2到1：4，根據(jù)類器官生長(zhǎng)情況具體判斷。
   1. S3階段：S2階段誘導(dǎo)12天后，3D培養(yǎng)物用基礎(chǔ)培養(yǎng)基輕柔洗2次，加入適量S3完全培養(yǎng)基，S3階段3D傳代同S2階段，S3階段共20天，形成立體的含肺譜系多種類型細(xì)胞的肺類器官。
8. 以上所有操作均在無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行，細(xì)胞開(kāi)放操作要在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行；該研究常用的培養(yǎng)器皿包括培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板，也可自行設(shè)計(jì)方案使用細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞工廠等，請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行選擇；細(xì)胞的初始狀態(tài)對(duì)分化的成功至關(guān)重要，請(qǐng)務(wù)必保證初始細(xì)胞的可靠性。該試劑盒僅用于定型內(nèi)胚層細(xì)胞向肺類器官分化的研究，用于其他研究時(shí)該操作規(guī)程僅作為參考。

 

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