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iFluor 720琥珀酰亞胺酯
英文名稱(chēng):iFluor® 720 succinimidyl ester總訪問(wèn):87
國(guó)產(chǎn)/進(jìn)口:進(jìn)口半年訪問(wèn):1
產(chǎn)地/品牌:AAT Bioquest產(chǎn)品類(lèi)別:生化試劑
規(guī)       格:1046 最后更新:2024-8-2
貨       號(hào):1046
CAS   號(hào):
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  • 公司簡(jiǎn)介
產(chǎn)品參數(shù)
Ex (nm) 716 Em (nm) 740
分子量 1089.29 溶劑 DMSO
存儲(chǔ)條件 在零下15度以下保存, 避免光照
簡(jiǎn)要概述

iFluor 720琥珀酰亞胺酯是iFluor系列熒光標(biāo)記染料之一,可以覆蓋整個(gè)可見(jiàn)光譜。所有iFluor 染料都具有優(yōu)異的水溶性,它們的親水性使有機(jī)溶劑的使用極小化。與常規(guī)的染料(如FITC,TRITC,Texas Red ,Cy3 ,Cy5和Cy7)相比,iFluor 染料具有更好的標(biāo)記性能。一些iFluor 染料在某些抗體上明顯優(yōu)于Alexa Fluor 標(biāo)記染料。它們是用于標(biāo)記蛋白質(zhì)和核酸的極便宜的熒光染料(替代Alexa Fluor 染料)。每種iFluor染料的開(kāi)發(fā)都與特定的Alexa Fluor 或其他標(biāo)記染料(如DyLight 染料)的光譜特性相匹配。

琥珀酰亞胺基(NHS)酯被證明是用于胺修飾的極佳試劑,因?yàn)樾纬傻孽0锋I基本上與天然肽鍵相同并且穩(wěn)定。這些試劑通常是穩(wěn)定的并且與脂族胺顯示出良好的反應(yīng)性和選擇性。當(dāng)琥珀酰亞胺酯化合物用于綴合反應(yīng)時(shí),需要考慮的因素很少:1.溶劑:在大多數(shù)情況下,活性染料應(yīng)溶于無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亞砜(DMSO)中。 2.反應(yīng)pH:胺與琥珀酰亞胺酯的標(biāo)記反應(yīng)強(qiáng)烈依賴于pH。胺反應(yīng)性試劑與非質(zhì)子化脂族胺基團(tuán)反應(yīng),包括蛋白質(zhì)的末端胺和賴氨酸的β-氨基。因此,胺酰反應(yīng)通常在pH 7.5以上進(jìn)行。被琥珀酰亞胺酯修飾的蛋白質(zhì)是具有代表性的,通常在pH 8.5-9.5下合成。 3.反應(yīng)緩沖液:使用胺反應(yīng)試劑時(shí),必須避免使用含有游離胺(如Tris和甘氨酸)和硫醇化合物的緩沖液。廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的銨鹽(例如硫酸銨和乙酸銨)也必須在進(jìn)行染料綴合之前除去(例如通過(guò)透析)。 4.反應(yīng)溫度:大多數(shù)綴合在室溫下進(jìn)行。特定標(biāo)記反應(yīng)可能需要升高或降低的溫度。iFluor系列染料是AF系列染料的替代品。

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

染色樣本分析

溶液配制

1.蛋白質(zhì)原液配制(溶液A)

將100μL反應(yīng)緩沖液(如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液,pH~9.0)與900μL目標(biāo)蛋白溶液(如抗體,蛋白質(zhì)濃度> 2 mg / ml,如果可能)混合至100μL,再加入1 mL蛋白質(zhì)標(biāo)記原液。

注1:蛋白質(zhì)溶液(溶液A)的pH值應(yīng)為8.5±0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0,則使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。

注2:蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中,則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析,以除去廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽(例如硫酸銨和乙酸銨)。

注3:不純的抗體、穩(wěn)定的牛血清蛋白(BSA)抗體或明膠不會(huì)被很好的標(biāo)記。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)。可以通過(guò)透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊氮化鈉或硫柳汞,以獲得極佳標(biāo)記結(jié)果。

注4:如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg / mL,則結(jié)合效率會(huì)顯著降低。為獲得極佳標(biāo)記效率,建議最終蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.iFluor 720琥珀酰亞胺酯原液配制

將無(wú)水DMSO加入到iFluor 720 SE小瓶中以制備10-20mM儲(chǔ)備溶液。 通過(guò)移液或渦旋混合均勻。

注意:在開(kāi)始綴合前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液(溶液B),及時(shí)使用。 染料儲(chǔ)備溶液的長(zhǎng)期儲(chǔ)存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存兩周,避光保存。 避免凍融循環(huán)。

 

操作步驟 

該標(biāo)記方案是為山羊抗小鼠 IgG 與 iFluor 720 SE 的結(jié)合而開(kāi)發(fā)的。您可能需要進(jìn)一步優(yōu)化您的特定蛋白質(zhì)。 注意 每種蛋白質(zhì)需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例,這也取決于染料的特性。蛋白質(zhì)的過(guò)度標(biāo)記會(huì)對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響,而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會(huì)降低靈敏度。 

1.進(jìn)行綴合反應(yīng):

1.1使用 10:1 的溶液 B(染料)/溶液 A(蛋白質(zhì))的摩爾比作為起點(diǎn):將 5 µL 染料儲(chǔ)備溶液(溶液 B,假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為 10 mM)添加到蛋白質(zhì)小瓶中溶液(95 µL 溶液 A)有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為 10 mg/mL 且蛋白質(zhì)的分子量為 ~200KD,則蛋白質(zhì)的濃度為 ~0.05 mM。

注意:我們建議使用 10:1 摩爾比的溶液 B(染料)/溶液 A(蛋白質(zhì))。如果太低或太高,分別確定最佳染料/蛋白質(zhì)比例為 5:1、15:1 和 20:1。

1.2在室溫下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物 30-60 分鐘。

 

2.純化綴合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的實(shí)例。

2.1按照制造說(shuō)明準(zhǔn)備Sephadex G-25色譜柱。

2.2將反應(yīng)混合物(直接從步驟4)加載到Sephadex G-25柱的頂部。

2.3樣品在頂部樹(shù)脂表面下方運(yùn)行時(shí)立即加入PBS(pH 7.2-7.4)。

2.4向所需樣品中加入更多PBS(pH 7.2-7.4)以完成色譜柱純化。

注1:立即使用時(shí),染料 - 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋?zhuān)⒌确侄啻问褂谩?/span>

注2:對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存,染料 - 蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

 

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