中文名稱：Ad-GFP-LC3B
英文名稱：Adenovirus expressing GFP-LC3B fusion protein
產(chǎn)品規(guī)格：ml|0×ml
發(fā)貨周期：～3天
Ad-GFP-LC3B本品是一種可以表達(dá)GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒，可以用于感染細(xì)胞或組織后進(jìn)行細(xì)胞自噬(autophagy)的檢測。
LC3是酵母自噬關(guān)鍵蛋白ATG8在哺乳動物中的同源蛋白。LC3最初被分析鑒定為microtubule-associated protein light chain 3 。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亞家族，其中對于LC3B的研究最為廣泛。到目前為止，LC3B被認(rèn)為是細(xì)胞自噬信號通路最為關(guān)鍵的標(biāo)志性蛋白。LC3B是一個具有25個氨基酸殘基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22個氨基酸蛋白，從而暴露出C端的甘氨酸，人們把它命名為胞質(zhì)形式的LC3B I。在細(xì)胞自噬的過程中，其C端暴露的甘氨酸經(jīng)過一個類似泛素化的過程，以ATG7為E樣激活酶， 以ATG3為E2樣連接酶，以Atg2-Atg5-Atg6復(fù)合物為E3樣連接酶，在C端甘氨酸上共價連接上磷脂酰乙醇胺而成為LC3B-PE即LC3B II。與胞質(zhì)定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬體的內(nèi)膜和外膜上。在自噬體與溶酶體融合后，自噬體外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬體內(nèi)膜上的LC3B II則被溶酶體內(nèi)的蛋白酶所降解。盡管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其極強的疏水性，在SDS-PAGE電泳時，LC3B II比LC3B I遷移得更快，其表觀分子量分別為4kD和6kD。在用GFP-LC3B腺病毒感染細(xì)胞后，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B以彌散的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以斑點的形式表現(xiàn)出來。
自噬是一種在進(jìn)化上高度保守的通過溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關(guān)，在饑餓等不利的環(huán)境條件下， 細(xì)胞通過自噬降解多余或異常的細(xì)胞內(nèi)組分，為細(xì)胞的生存提供能量及原材料，促進(jìn)生物體的生長發(fā)育、細(xì)胞分化及對環(huán)境變化產(chǎn)生應(yīng)答。自噬異常與多種病理過程如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關(guān)系。由于細(xì)胞自噬在生理和病理過程中都有重要作用，自噬已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一個新的研究熱點。
Ad-GFP-LC3B是重組腺病毒，感染后能夠在靶細(xì)胞中有效表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，可以用于細(xì)胞自噬的檢測。
腺病毒感染細(xì)胞后為瞬時表達(dá)，通常不會與基因組DNA重組，不能用于篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。本產(chǎn)品感染體內(nèi)外細(xì)胞后，有效表達(dá)時間通常不少于7天，不同細(xì)胞和組織的有效表達(dá)時間有所不同。感染0-4天后融合蛋白的表達(dá)很可能會大大減弱。
Ad-GFP-LC3B采用了成熟的E缺陷型重組腺病毒載體系統(tǒng)，感染普通的細(xì)胞后不能進(jìn)行擴增和重組，從而可以有效降低本產(chǎn)品在活體生物中的風(fēng)險。
本產(chǎn)品可以在表達(dá)E的HEK293A、HEK293等適當(dāng)細(xì)胞中擴增。
本產(chǎn)品的滴度≥×08 pfu/ml，使用時可以按照08pfu/ml進(jìn)行計算。如果按照20 MOI感染6孔板的細(xì)胞，每孔50萬細(xì)胞計算，共可以感染0個孔；如果按照20 MOI感染24孔板的細(xì)胞，每孔0萬細(xì)胞計算，共可以感染50個孔。如果MOI值提高，則相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會減少；如果MOI值降低，則相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會增加。
儲存條件：-20℃，有效期～2個月。

注意事項：
、懸浮細(xì)胞用此法時必須經(jīng)離心后才能吸出上清再加DMSO。
2、Formazan 的生成不僅與活細(xì)胞數(shù)成比例，也受作用時間的影響，因此當(dāng)樣品較多時測定的OD 值可能隨時間而變。
3、MTT 溶液為黃色，需避光保存，長時間光照會導(dǎo)致失效。當(dāng)顏色變?yōu)榛揖G色時，請勿使用。MTT 溶液在4℃或較低溫度情況下會凝固，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
4、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
PPHP （500 ug）     5phenyl4Epentenylhydroperoxide； PPHP
4（3’Chloroanilino）6，7dimethoxyquinazoline； Tyrphostin AG      AG
Tizoxanide （5 mg）     2hydroxyN（5nitro2thiazolyl）benzamide； Tizoxanide
ICI （hydrochloride） （0 mg）     （2R,3R）rel[（2,3dihydro7methylHinden4yl）oxy]3[（methylethyl）amino]2butanol, monohydrochloride
’，4"Sophorolactone 6’，6"diacetate （500 mg）     S[[6Oacetyl2O（6OacetylβDglucopyranosyl）βDglucopyranosyl]oxy]9Zoctadecenoic acid， ，4’’ester； ’，4"Sophorolactone 6’，6"diacetate
5,6,7,Tetrahydromethyl5oxoHindolo[2,3a]py rrolo[3,4c]carbazolepropanenitrile; Go; PD 40     G
二硫代赤蘚糖醇，英文名或英文縮寫：DTE，級別：試劑級，98%，規(guī)格：KU
酮　OV20SILICONE OV20
β煙酰腺嘌呤二核苷酸，英文名或英文縮寫：βDPN，級別：BR,，250600u/mg，規(guī)格：25克
氧化酶 Alcohol Oxidase 90636 250U 通用試劑
拂西汀相關(guān)物質(zhì)B Fluoxqtinq Rqlctqd CoMpound B;NMqthyl3phqnylpropylcMinq 38
M63MEDIUMBROTHM63 培養(yǎng)基肉湯生物技術(shù)級白色粉末RT不sigma
蘭素拉唑相關(guān)物質(zhì)ALansoprazole Related CoMpound A;2[[[3metxyl4(2,2,2triflouroethoxy)2pyridyl]metxyl]sulfonyl]benziMidazole
2Bromo5chloro3metxylbenzo[b]thiopxene 5203608
基 Methyl carbamate,98% 50 00G 通用試劑
順二酸/馬來酸/異二酸/失水蘋果酸/Maleic acid AR，99%， 500克 國產(chǎn)/進(jìn)口
小鼠組蛋白H2B(H2B)ELISA試劑盒 ，英文名： H2B ELISA Kit
山羊γ干擾素(IFN-γ)ELISA檢測試劑盒GoatIerferonγ,IFN-γELISAKit 96T/48T
犬血纖蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)免疫試劑盒 Canine Fibrinogen Degradation Product,FDP ELISA Kit
英文名稱Mouse7-ANPELISAKit小鼠7-羥-孕同(7-ANP)規(guī)格：96T/48T
腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(EerotoxigenicE.coli)鑒定6SrDNAPCR擴增檢測試劑盒20次
RatFreeThyroxine,FT4ELISA試劑盒大鼠游離甲狀腺素(FT4)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
小鼠β-防御素(β-DF)ELISA試劑盒 ，英文名： β-DF ELISA Kit
大鼠巨噬細(xì)胞炎癥蛋白α(MIP-α/CCL3)ELISA檢測試劑盒Ratmacrophageinflammatoryproteinα,MIP-αELISAKit 96T/48T
人N鈣黏蛋白/神經(jīng)鈣黏蛋白(N-Cad)免疫試劑盒 Human N-Cad ELISA kit
英文名稱MouseANCAELISAKit小鼠抗嗜中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)規(guī)格：96T/48T
苯甲酰酰膽堿酯酶活性化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑盒20次
rabbitTissuePolypeptideAigen,TPAELISA試劑盒兔子組織多肽抗原(TPA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
操作規(guī)程
、在96孔板加入細(xì)胞00μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入00微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入00微升5000～0000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.
2、.加入適當(dāng)濃度的0～0μL 受試化合物。
3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及00%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。
4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成× MTT 溶液。
5、每孔加50μL × MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。
6、吸出上清液，每孔加50μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。
7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。
Ad-GFP-LC3B8、結(jié)果分析
 a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（完全培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（完全培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×00
 b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 0%時的藥物濃度(IC90)

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