血液總脂肪酶（lipase）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

血液總脂肪酶（lipase）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)底物三丁酸二巰基丙醇受到脂肪酶水解，釋放出巰基基團(tuán)，使用Ellman試劑，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心改良、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物和人體血液（血漿、血清等）樣品脂肪酶的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

脂肪酶（lipase；EC3.1.1.3）是可溶性糖蛋白分子，催化不溶性脂質(zhì)分子的酯鍵（ester bond）的水解。在人體中，其來(lái)源于胰腺產(chǎn)生。在消化系統(tǒng)中，脂肪酶（Lipase），裂解脂肪分子，例如甘油三酯（triglyceride；TAG），產(chǎn)生1個(gè)分子甘油（glycerol）和3個(gè)分子游離脂肪酸分子（fatty acid）。脂肪酶異常增高與胰腺炎、胰腺管阻塞、胰腺癌、腎病、唾液腺炎癥、腸道阻塞等相關(guān)；異常降低則與胰腺中脂肪酶產(chǎn)生細(xì)胞的永久性損傷有關(guān)。脂肪酶的活性檢測(cè)是臨床診斷的指標(biāo)之一。基于脂肪酶在水分子的參與下，催化三丁酸二巰基丙醇（dimercaptopropanol tributyrate；DMPTB或BALB）的水解，產(chǎn)生二巰基丙醇（dimercaptopropanol；DMP），并釋放出巰基基團(tuán)（－SH），進(jìn)而與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過(guò)其吸收峰值的變化（412nm波長(zhǎng)），來(lái)定量分析脂肪酶的活性。脂肪酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

lipase

DMPTB  +  H2O  →  DMP  +  TB

 

DTNB  +  DMP -SH  →   TNB  +  DMP -S-S-TNB

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

緩沖液（Reagent A） 10毫升

反應(yīng)液（Reagent B）  1毫升

底色液（Reagent C）     500微升

補(bǔ)充液（Reagent D）     500微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

 

保存方式

 

保存反應(yīng)液（Reagent B）和底色液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent C）避免光照，有效保證6月

 

用戶(hù)自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

比色皿或96孔板：用于反應(yīng)和比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

選擇一：血漿樣品

• 準(zhǔn)備好肝素或ACD等抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

 

選擇二：血清樣品

1． 準(zhǔn)備好不含抗凝劑的儲(chǔ)存管 

• 抽取1毫升血液，置于儲(chǔ)存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結(jié)
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品，置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)412nm，間隔10分鐘，讀數(shù)4次（共30分鐘），并置零 
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

 

三、背景對(duì)照測(cè)定

 

• 移取910微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入40微升底色液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測(cè)樣品（或100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

• 樣品測(cè)定

 

• 移取810微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入40微升底色液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測(cè)樣品（或100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

• 計(jì)算樣品活性

  

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 1（體系容量；毫升）]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 30（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾DMPTB/分鐘

 

六、酶標(biāo)儀測(cè)定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取205微升緩沖液（Reagent A）到所有孔里
• 加入25微升反應(yīng)液（Reagent B）到樣品孔里
• 加入25微升陰性液（Reagent D）到背景對(duì)照孔里
• 分別加入10微升底色液（Reagent C）到所有孔里
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入10微升待測(cè)樣品（或20微克蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈，且pH為7.2）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)，包括（0分鐘初始讀數(shù)和30分鐘讀數(shù)）
• 活性計(jì)算

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 30（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾DMPTB/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次（96孔板，包括20次樣品和20次背景對(duì)照）和5次（比色皿，包括5次樣品和5次背景對(duì)照）操作
• 本產(chǎn)品檢測(cè)范圍是40至1600毫單位/毫升
• 建議血液樣品采集后3小時(shí)內(nèi)制備完成
• 操作時(shí)，須戴手套
• 每次樣品測(cè)定，需要背景測(cè)定一次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 樣品中避免含有EDTA、TWEEN20、NP40、巰基乙醇、DTT等，否則干擾檢測(cè)
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行比色測(cè)定
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 建議待測(cè)樣本的蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 酶活性單位濃度定義：在37℃下，pH 7.5的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）水解1微摩爾三丁酸二巰基丙醇
• 正常脂肪酶的參考值：

小鼠血清809±15毫單位/毫升

大鼠血漿959±23毫單位/毫升

大鼠血清665±14毫單位/毫升

山羊血清44±1毫單位/毫升

牛血清80±1毫單位/毫升

人血清75±6毫單位/毫升

人血漿52±2毫單位/毫升

• 血液干擾因子如下：

未結(jié)合膽紅素大于20毫克/分升

結(jié)合膽紅素大于25毫克/分升

血紅蛋白大于2000毫克/分升

甘油三酯大于1000毫克/分升

甘油大于250毫克/分升

抗壞血酸大于50毫克/分升

乳糜脂肪大于1%

 

• 本公司提供系列醫(yī)學(xué)生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

上海一基實(shí)業(yè)有限公司多年專(zhuān)供：ELISA試劑盒，PCR恒溫?zé)晒鉁y(cè)試盒、朗道校準(zhǔn)品、校準(zhǔn)質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品|對(duì)照品、抗體|抗原、生物試劑、動(dòng)物血清、人類(lèi)CDNA、基因組DNA、MicroRNA產(chǎn)品、總RNA產(chǎn)品、人原代細(xì)胞裂解液、生物試劑、高端試劑等系列產(chǎn)品。如需產(chǎn)品詳細(xì)說(shuō)明等物理性質(zhì)信息請(qǐng)聯(lián)系客服為您查詢(xún)！質(zhì)量保證，價(jià)格優(yōu)惠，是國(guó)內(nèi)生物試劑權(quán)威的供應(yīng)商之一，專(zhuān)業(yè)經(jīng)銷(xiāo)生物科學(xué)領(lǐng)域的品牌試劑：Sigma試劑、ASROS試劑、AIFA試劑、alding試劑、Fisher試劑、日本MBL試劑、美國(guó)劍橋CIL氘代試劑、ATCC菌株等品牌產(chǎn)品。擁有齊全的生產(chǎn)和檢測(cè)設(shè)備，實(shí)施嚴(yán)格的管理制度和完善的質(zhì)量保證體系，為廣大客戶(hù)提供全面的技術(shù)支持和完善的售后服務(wù)。歡迎來(lái)電咨詢(xún)!