活化凝血因子5（FACTOR Va）活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

活化凝血因子5（FACTOR Va）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過活化凝血因子X（FXa）及其輔因子活化凝血因子（FVa），激活凝血酶，進而水解多肽化合物底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA，釋放黃色對硝基苯胺，產(chǎn)生吸光峰值的變化，即采用比色法來測定血液樣品中活化凝血因子活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種血漿樣品（動物、人體等）活化凝血因子5的活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

凝血因子5（Factor V）是維生素K非依賴性的不穩(wěn)定性單鏈糖蛋白，由肝組織、內(nèi)皮組織、巨核細(xì)胞、血小板等合成。血小板中含有20至25%凝血因子5。凝血因子5，作為活化凝血因子10的輔因子，成為凝血酶原復(fù)合物一員，包括活化凝血因子10、鈣離子和磷脂等，其功能在于轉(zhuǎn)化凝血酶原為凝血酶（THROMBIN；EC3.4.21.5），即活化凝血因子II（Activated Factor II；Factor IIa），構(gòu)成常見（common）凝血通路或機制。肝病、彌散性血管內(nèi)凝血（Disseminated intravascular coagulation；DIC）、原發(fā)性纖維蛋白溶解癥（primary fibrinolysis）等引起凝血因子5減少或缺失。凝血因子5缺失將導(dǎo)致凝血酶原時間（prothrombin time；PT）和活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time；APTT）延長，而出現(xiàn)出血體質(zhì)。活化凝血因子X（FXa）及其輔因子活化凝血因子（FVa）一起，在鈣離子和磷脂的參與下，使凝血酶原（prothrombin）轉(zhuǎn)化為凝血酶（thrombin），由此水解人工合成的多肽化合物底物H-D-Phe-Pip- Arg-pNA（HD-苯丙氨酰- pipecolyl-精氨酰對硝基苯胺），釋放有色對硝基苯胺，在分光光度儀（405nm 波長）下，測定吸光峰值的變化，來定量測定活化凝血因子V的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

       Factor Xa/FactorVa

Prothrombin   →   thrombin

 

Thrombin

H-D-Phe-Pip- Arg-pNA    →  H-D-Phe-Pip- Arg-OH  +   pNA

                                （黃色）

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

處理液（Reagent A）  20管

稀釋液（Reagent B）     5毫升

緩沖液（Reagent C）   2毫升

反應(yīng)液（Reagent D）     1毫升

底物液（Reagent E）     2毫升

產(chǎn)品說明書      1份

 

 

保存方式

 

保存在-20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

抗凝管：用于血液采集的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器

微型臺式離心機：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

96孔板或200微升1厘米光徑比色皿：用于樣品比色測定的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

 

實驗步驟

  

• 樣品制備

 

• 準(zhǔn)備好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 移取500微升血漿到1管處理液（Reagent A）管中，混勻
• 室溫下，平放于小型臺式平式搖床孵育15分鐘，速度為50至100RPM
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g 
• 小心移取400微升上清到新的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存
• （或繼續(xù)后續(xù)操作）移取50微升上述預(yù)處理的血漿到新的1.5毫升離心管
• 加入200微升稀釋液（Reagent B），混勻
• 即刻置于冰槽里備用

 

• 測定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好上述制備的待測樣品
• 設(shè)定好酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長405nm，間隔30秒，讀數(shù)5次（共2分鐘）
• 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 活性測定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
• 分別移取100微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
• 分別加入10微升稀釋液（Reagent B）或上述制備的待測樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 分別加入40微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 在37℃溫度下孵育2分鐘
• 分別加入100微升底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板（注意：避免氣泡）
• 即刻放進酶標(biāo)儀檢測或轉(zhuǎn)移到200微升比色皿，在分光光度儀里檢測（注意：可見反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見的黃色）
• 活性計算：

 

• 酶標(biāo)儀檢測

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X  5（樣品稀釋倍數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.010（樣品容量；毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 2（反應(yīng)時間；分鐘）X 0.6（光徑距離；厘米）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

 

• 比色皿檢測

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 5（樣品稀釋倍數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 2（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融
• 如果為非血漿樣品，可以跳過樣品預(yù)處理，直接進行樣品活性檢測
• 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)2分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定2分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 活化凝血因子5單位活性定義為：在37℃，pH 7..5條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾多肽化合物底物H-D-Phe-Pip- Arg-pNA所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列凝血因子檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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