細(xì)菌F型ATP酶（F type ATPase ）活性酶連續(xù)反應(yīng)光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

細(xì)菌F型ATP酶（F type ATPase ）活性酶連續(xù)反應(yīng)光度法定量檢測試劑是一種旨在使用F型ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，在寡霉素參與下，測定與ATP合成對應(yīng)的ATP水解產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光度法測定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細(xì)菌細(xì)胞F型ATP酶/ATP合成酶的特異性活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

 

技術(shù)背景

 

腺苷三磷酸酶，又稱為ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），屬于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機磷。ATP酶的去磷酸化反應(yīng)釋放出能量，成為細(xì)胞生命代謝的能源。ATP酶為跨膜蛋白（transmembrane），幫助傳輸各種代謝分子進(jìn)出細(xì)胞。根據(jù)ATP酶的結(jié)構(gòu)和功能，分為五類不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。P型，又稱為E1E2 型，存在于細(xì)菌和真核細(xì)胞膜和細(xì)胞器上，其功能在于水解ATP獲得能量，跨膜運輸各種化學(xué)分子，包括Ca²⁺傳輸性、Na⁺-K⁺ /H⁺-K⁺傳輸性、H⁺傳輸性和所有細(xì)菌型等，其中胃氫/鉀ATP酶，一種與胃酸分泌相關(guān)的質(zhì)子泵，屬于這一類型。V型，又稱為V1V0型，主要存在于真核細(xì)胞的液泡（vacuole）中。A型，又稱為A1A0型，存在于古生菌（archaea）中。E型，為細(xì)胞表面的酶。V型，又稱為V1V0型，也稱為氫V型ATP酶，主要存在于所有真核細(xì)胞的囊泡（vacuole或vesicle）中。F型ATP酶（F type ATPase），又稱為ATP合成酶（ATP synthase）、F1F0 ATP酶（F1F0 ATPase）和線粒體呼吸鏈復(fù)合物V（complex V），主要在線粒體、葉綠體或細(xì)菌細(xì)胞膜上，進(jìn)行氧化磷酸化或光合作用。細(xì)菌質(zhì)膜型F型ATP酶主要有兩個結(jié)構(gòu)域：F0為質(zhì)子轉(zhuǎn)運通道，由3個膜蛋白構(gòu)成，包括a、b、c等；和F1催化活性結(jié)構(gòu)域，由水溶性的α3β3γδε蛋白構(gòu)成。其最特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。細(xì)菌F型ATP酶的主要功能通過ATP合成的逆向反應(yīng)，水解ATP，產(chǎn)生膜內(nèi)外質(zhì)子梯度變化，幫助細(xì)菌離子轉(zhuǎn)運和鞭毛運動（flagella motility）。基于ATP，在寡霉素參與下，受到F型ATP酶的水解，進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），產(chǎn)生的吸光峰值的變化（340nm），來定量分析F型 ATP酶活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

F-type ATPase

 ATP   →   ADP  +  Pi

 

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP

         

lactate dehydrogenase

pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

                     （高吸收峰） （低吸收峰）

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

裂解液（Reagent A）    10毫升

保存液（Reagent B）   5毫升

緩沖液（Reagent C）  20毫升

反應(yīng)液（Reagent D）      2.5毫升

陰性液（Reagent E）     2毫升

底物液（Reagent F） 500微升

專性液（Reagent G）   250微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；反應(yīng)液（Reagent D），避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

恒溫?fù)u床：用于細(xì)菌培養(yǎng)

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度儀：用于光度分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好10毫升待測的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM
• 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升
• 置于冰槽里5分鐘
• 放進(jìn)4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里30分鐘，期間強力渦旋震蕩15秒三次
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為300g（或1000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心去掉上清液 
• 加入200微升保存液（Reagent B），混勻
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

二、測定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好上述待測樣品，置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 背景對照測定

 

• 移取780微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入20微升底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入100微升陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)1分鐘或5分鐘

 

• 樣品總活性測定

 

• 移取780微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入20微升底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入100微升待測樣品（注意：50微克細(xì)菌總蛋白；樣品須溶解；參見注意事項4）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)1分鐘或5分鐘

 

• 樣品非特異活性測定

 

實驗開始前，移取100微升待測樣品（注意：50微克細(xì)菌總蛋白；樣品須溶解；參見注意事項4）到1.5毫升離心管，加入20微升專性液（Reagent G），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

 

• 移取760微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入20微升底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
• 加入120微升上述預(yù)處理的待測樣品
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)1分鐘或5分鐘

 

• 計算樣品活性

 

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

 

【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)】÷【0.1（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù) X 1或5（反應(yīng)時間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

2）樣品特異活性

 

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

 

• 酶標(biāo)儀測定

 

• 樣品總活性測定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品總活性
• 分別移取195微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中
• 分別加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 分別加入5微升底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入25微升陰性液（Reagent E）或待測樣品（注意：25微克細(xì)菌總蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 背景對照和樣品總活性實際讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)1分鐘或5分鐘
• 活性計算

 

【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)】÷【0.025（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù) X 1或5（反應(yīng)時間；分鐘）X 0.6（光徑距離；厘米）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

• 樣品非特異活性測定

 

實驗開始前，移取25微升待測樣品（注意：25微克細(xì)菌總蛋白；樣品須溶解；參見注意事項4）到1.5毫升離心管，加入5微升專性液（Reagent G），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

 

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測樣品
• 移取190微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中
• 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入5微升底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入30微升上述預(yù)處理的待測樣品
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 樣品非特異活性實際讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)1分鐘或5分鐘
• 活性計算

 

【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)】÷【0.025（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù) X 1或5（反應(yīng)時間；分鐘）X 0.6（光徑距離；厘米）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

• 樣品特異活性計算

 

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為21次操作（10個樣本），包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品忌用磷酸緩沖溶液 
• 建議使用細(xì)菌細(xì)胞膜裂解懸液。如果使用細(xì)菌細(xì)胞裂解懸液，第一須澄清；第二須加50微克
• 加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測定
• 反應(yīng)測定值由高到低變化；測定可以持續(xù)5分鐘
• 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數(shù)高于5分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性
• 光度測定后，比色皿須清洗徹底
• 建議待測樣本細(xì)菌膜蛋白濃度為20微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調(diào)整 （本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 樣品特異活性是指寡霉素敏感的ATP合成酶
• F型ATP酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列ATP酶類技術(shù)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確

上海一基實業(yè)有限公司多年專供：ELISA試劑盒，PCR恒溫?zé)晒鉁y試盒、朗道校準(zhǔn)品、校準(zhǔn)質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品|對照品、抗體|抗原、生物試劑、動物血清、人類CDNA、基因組DNA、MicroRNA產(chǎn)品、總RNA產(chǎn)品、人原代細(xì)胞裂解液、生物試劑、高端試劑等系列產(chǎn)品。如需產(chǎn)品詳細(xì)說明等物理性質(zhì)信息請聯(lián)系客服為您查詢！質(zhì)量保證，價格優(yōu)惠，是國內(nèi)生物試劑權(quán)威的供應(yīng)商之一，專業(yè)經(jīng)銷生物科學(xué)領(lǐng)域的品牌試劑：Sigma試劑、ASROS試劑、AIFA試劑、alding試劑、Fisher試劑、日本MBL試劑、美國劍橋CIL氘代試劑、ATCC菌株等品牌產(chǎn)品。擁有齊全的生產(chǎn)和檢測設(shè)備，實施嚴(yán)格的管理制度和完善的質(zhì)量保證體系，為廣大客戶提供全面的技術(shù)支持和完善的售后服務(wù)。歡迎來電咨詢!