組織II型L-3羥酰基-CoA 脫氫酶/β淀粉樣蛋白結(jié)合乙醇脫氫酶活性

光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

組織II型L-3羥�；�-CoA 脫氫酶/β淀粉樣蛋白結(jié)合乙醇脫氫酶（HADHII/ABAD）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過逆向反應(yīng)中底物還原的同時，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用光度法來測定組織裂解樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品（動物、人體、昆蟲等）II型L-3羥�；�-CoA 脫氫酶/β淀粉樣蛋白結(jié)合乙醇脫氫酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

II型L-3羥�；�輔酶A脫氫酶（L-3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase；HADHII；EC 1.1.1.35），又稱為β淀粉樣蛋白結(jié)合乙醇脫氫酶（amyloid β-peptide binding alcohol dehydrogenase；ABAD）、10型17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 10；HSD17B10）、2-甲基-3-羥丁�；�輔酶A脫氫酶（2-methyl-3-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase；MHBD）等，是一種主要的線粒體酶，屬于短鏈脫氫酶/還原酶（short chain dehydrogenasereductase；SDR）超家族。HADHII/ABAD可逆性地催化線粒體中脂肪酸β氧化的第三步過程，氧化L-3羥�；�-CoA的羥基基團為酮基基團，同時還原NAD^＋為NADH。HADHII/ABAD催化廣譜的底物氧化活性，包括線性醇類、分枝脂肪酸（4至16碳）、羥酰基輔酶A衍生物、3-羥丁酰輔酶A、氨基酸代謝產(chǎn)物和羥類固醇等。其活性區(qū)域含有進化保留的谷氨酸-組氨酸對，具有催化作用機制。其為同源四體蛋白，每個單體為27kd。HADHII/ABAD的基因突變和缺失與阿茲罕默癥和巴金森氏癥相關(guān)�；�于HADHII/ABAD催化反應(yīng)的可逆性，3-酮乙酰輔酶A（3-ketoacyl-CoA ）在該酶的作用下，轉(zhuǎn)化為L-3-羥乙酰基輔酶A （L-3-hydroxyacyl-CoA），同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），根據(jù)NADH的變化（340nm 波長），來定量分析II型L-3羥酰基-CoA 脫氫酶/β淀粉樣蛋白結(jié)合乙醇脫氫酶的總活性。HADHII/ABAD反應(yīng)系統(tǒng)為：

HADHII/ABAD 

3-ketoacyl-CoA  +  NADH  +  H⁺    →  L-3-hydroxyacyl-CoA  +  NAD⁺

（高吸收峰）                （低吸收峰）

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）   5毫升

反應(yīng)液（Reagent D）      500微升

底色液（Reagent E）   500微升

陰性液（Reagent F）   500微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent D）和底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于光度分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

 

• 樣品準備

 

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的500微升裂解液（Reagent B） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/em>）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測定準備

 

• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent E）避免光照
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

 

• 移取195微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入25微升底色液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入5微升陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）

 

• 樣品測定

 

• 移取195微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入25微升底色液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入5微升待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）

 

五、計算樣品活性

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

• 酶標儀測定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標記：背景對照和樣品
• 分別移取195微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 分別加入25微升底色液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入5微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計算：

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 建議使用比色皿測定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 加樣后3秒內(nèi)光度測定
• 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)10分鐘
• 光度測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為20微克/5微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• II型L-3羥�；�-CoA 脫氫酶/β淀粉樣蛋白結(jié)合乙醇脫氫酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列線粒體酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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