體液環(huán)氧化酶總活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）

主要用途

體液環(huán)氧化酶（CYCLOOXYGENASE）總活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過底物花生四烯酸在環(huán)氧化酶催化的加氧和過氧化作用產(chǎn)生前列腺素H2的同時(shí)，輔助生色底物四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽氧化后峰值的增高，即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種體液樣品（血液、血清、血漿、尿液等）環(huán)氧化酶的總活性檢測(cè)以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

環(huán)氧化酶（cyclooxygenase；COX；EC1.14.99.1），又稱為前列腺素H合成酶（prostaglandin H synthase；PGHS），是一種具有環(huán)氧化酶和過氧化酶活性的二重功能的酶，其功能在于生成重要的生物調(diào)節(jié)因子（mediator）前列腺素類物質(zhì)（prostanoids），包括前列腺素（prostaglandin；PG）、環(huán)前列腺素（Prostacyclin；PGI2）、血栓素（Thromboxane）等。環(huán)氧化酶有2種同工酶，70KD的環(huán)氧化酶1（COX-1）和72KD的環(huán)氧化酶2（COX-2），其中環(huán)氧化酶1有一種變異體，稱為環(huán)氧化酶3、環(huán)氧化酶1b或環(huán)氧化酶1v（COX-1 variant）。同工酶具有65％的氨基酸序列同源和近似相同的催化部位，但抑制位置不同。環(huán)氧化酶1為結(jié)構(gòu)性（constitutive）酶，存在于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，尤其在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)；環(huán)氧化酶2為誘導(dǎo)性（inducible）酶，在正常組織中難以檢測(cè)，炎癥后或佛波醇酯（phorbol ester）、脂多糖、細(xì)胞因子等誘導(dǎo)激活，尤其在巨噬細(xì)胞表達(dá)顯著增高。環(huán)氧化酶中的加氧作用催化花生四烯酸（arachidonic acid；AA），一種ω-6多不飽和脂肪酸（ω-6 PUFA），轉(zhuǎn)化為氫過氧化內(nèi)過氧化物前列腺素G2（hydroperoxy endoperoxide prostaglandin G₂；PGG₂）；環(huán)氧化酶中的過氧化作用催化氫過氧化內(nèi)過氧化物前列腺素G2還原為前列腺素醇類物質(zhì)前列腺素H2（prostaglandin H2；PGH2），即前列腺素類物質(zhì)前體。非類固醇類抗炎藥物，例如阿司匹林和異丁苯丙酸（ibuprofen）等是環(huán)氧化酶抑制劑，用于緩解炎癥和疼痛�；�于底物花生四烯酸在環(huán)氧化酶催化的加氧作用下，轉(zhuǎn)化成前列腺素G2，同時(shí)在還原性輔助生色底物四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽（N,N,N',N'-Tetramethyl- p-phenylenediamine；TMPD）的存在下，環(huán)氧化酶進(jìn)一步催化其過氧化作用，還原前列腺素G2為前列腺素H2，同時(shí)氧化生色底物為藍(lán)色產(chǎn)物，通過其吸光峰值的變化（590nm 波長(zhǎng)），來(lái)定量分析環(huán)氧化酶的總活性。環(huán)氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

cyclooxygenas

arachidonic acid    →   prostaglandin G₂   

                             

peroxidase

prostaglandin G₂  +  2 reduced TMPD   →   prostaglandin H2   +  2 oxidized TMPD

              

產(chǎn)品內(nèi)容

 

裂解液（Reagent A）  20毫升

緩沖液（Reagent B）   3毫升

反應(yīng)液（Reagent C）      200微升

底物液A（Reagent D1）   1毫升

底物液B（Reagent D2）        4管

陰性液（Reagent E）   500微升

產(chǎn)品說(shuō)明書      1份

 

保存方式

 

保存緩沖液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent C）和底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里； 其余的保存在4℃冰箱里，反應(yīng)液（Reagent C）和底物液（Reagent D）避免光照；底物液B（Reagent D2）嚴(yán)禁反復(fù)凍融；有效保證2月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

選擇一：血漿樣品

• 準(zhǔn)備好肝素或ACD等抗凝管 （注意：避免使用EDTA等抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

 

選擇二：血清樣品

1． 準(zhǔn)備好不含抗凝劑的儲(chǔ)存管 

• 抽取1毫升血液，置于儲(chǔ)存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結(jié)
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

 

選擇三：血小板樣品

• 準(zhǔn)備好肝素抗凝管
• 抽取5毫升血液，置于抗凝管里
• 轉(zhuǎn)移到15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為200g（或1000RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心移取上清液到新的15毫升離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為2000g（或3500RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升裂解液（Reagent A），混勻
• 渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1） 

 

選擇四：尿液/腦脊液/唾液/精液樣品 

• 準(zhǔn)備好1.5毫升離心管
• 移取1毫升液體到離心管 
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管 
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• 移取10微升到新的1.5毫升離心管

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)590nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液（Reagent C）避免光照
• 緩沖液（Reagent B）室溫下均衡溫度
• 實(shí)驗(yàn)開始前，將底物液A（Reagent D1）和1管底物液B（Reagent D2）融化，然后移取250微升底物液A（Reagent D1）到1管底物液B（Reagent D2）里，混勻，標(biāo)記為底物工作液（可以進(jìn)行5次測(cè)定），置于冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 背景對(duì)照測(cè)定

 

• 移取140微升緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入10微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 加入50微升底物工作液
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育5分鐘
• 加入50微升陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

• 樣品測(cè)定

 

• 移取140微升緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入10微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 加入50微升底物工作液
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育5分鐘
• 加入50微升待測(cè)樣品（50微克蛋白）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

• 計(jì)算樣品活性

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 8.26（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）X 2]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾TMPD/分鐘

 

• 酶標(biāo)儀測(cè)定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取140微升緩沖液（Reagent B）到所有孔里
• 分別加入10微升反應(yīng)液（Reagent C）到所有孔里
• 分別加入50微升底物工作液到所有孔里
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在25℃溫度下孵育5分鐘
• 分別加入50微升陰性液（Reagent E）或待測(cè)樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔里
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)，包括0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 8.26（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）X 2]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾TMPD/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 底物工作液現(xiàn)做現(xiàn)配，不宜保存
• 避免使用SDS、Triton 100、Tween 20、Chaps、EGTA、DTT等處理樣本，否則干擾檢測(cè)
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次
• 建議使用比色皿測(cè)定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定
• 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)5分鐘
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測(cè)定5分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 環(huán)氧化酶單位活性定義為：在25℃，pH 8.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列細(xì)胞環(huán)氧化酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

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