組織a-淀粉酶（a-AMYLASE）活性DNS比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

組織a-淀粉酶（a-AMYLASE）活性DNS比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用具有還原力的黃色3,5-二硝基水楊酸與受到a-淀粉酶中性環(huán)境下水解產(chǎn)生的還原基團(tuán)分子反應(yīng)，生成強(qiáng)烈吸光的3-氨基-5-硝基水楊酸，即采用比色法測(cè)定其還原后峰值的升高變化，以此測(cè)定樣品中a-淀粉酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種組織（人體、動(dòng)物）等裂解萃取液樣品a-淀粉酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

 

技術(shù)背景

 

淀粉酶（AMYLASE）屬于糖苷水解酶類（glycoside hydrolase）。淀粉酶通過水解方式，分解淀粉的α-1，4鏈接，釋放出葡萄糖、麥芽糖（maltose）、麥芽三糖（maltotriose）、糊精（dextrin）等簡(jiǎn)單糖分子。淀粉酶分成三類：α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。其中α淀粉酶（EC 3.2.1.1），又稱為α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶（α-1,4-glucan 4-glucanohydrolase）或糖原酶（glycogenase），是鈣離子依賴性鈣金屬蛋白酶（calcium metalloenzyme），分解淀粉為葡萄糖、麥芽糖（maltose）、麥芽三糖（maltotriose）、糊精（dextrin）等，為主要的消化酶，尤其在人體中，例如唾液和胰淀粉酶等。β淀粉酶（EC 3.2.1.2），又稱為α-1,4-葡聚糖麥芽糖水解酶（1,4-α-D-glucan maltohydrolase）或糖基淀粉酶（saccharogen amylase），分解淀粉為葡萄糖等。植物、真菌、細(xì)菌等均能產(chǎn)生，而人體組織不含有。γ-淀粉酶（EC 3.2.1.2），又稱為α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷酶（Glucan 1,4-α-glucosidase）或溶酶體α-葡萄糖苷酶（lysosomal α-glucosidase），在酸性環(huán)境下分解淀粉為葡萄糖。淀粉是一種復(fù)雜分子，由多聚糖直鏈淀粉（amylose）和支鏈淀粉（amylopectin）構(gòu)成�；�于淀粉，在中性環(huán)境下，通過α-淀粉酶的水解，釋放出麥芽糖等含有游離的還原性基團(tuán)（例如酮基等），進(jìn)一步使用具有還原力的黃色3,5-二硝基水楊酸（3,5-Dinitrosalicylic acid；DNS）與之反應(yīng)，產(chǎn)生紅棕色的3-氨基-5-硝基水楊酸（3-amino-5-nitrosalicylic acid），在分光光度儀（540nm波長(zhǎng)）下測(cè)定，以定量分析α-淀粉酶的活性。其反應(yīng)方式為：   

α-AMYLASE

Starch  +  H2O       →      reducing groups（maltose）

     

Maltose  +  3,5-Dinitrosalicylic acid  →  3-amino-5-nitrosalicylic acid  +  maltonic acid

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）  20毫升

反應(yīng)液（Reagent D）   5毫升

底物液A（Reagent E）   5毫升

底物液B（Reagent F）  20毫升

補(bǔ)充液（Reagent G）  50毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）     2毫升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存 在4℃冰箱里；底物液B（Reagent F），避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2.2毫升離心管：用于配制標(biāo)準(zhǔn)樣品的容器

4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理

沸水裝置：用于反應(yīng)物孵育

比色皿：用于比色測(cè)定的容器

分光光度儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

一、樣品準(zhǔn)備

 

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的500微升裂解液（Reagent B） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/em>）
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作（注意：后續(xù)操作須在2小時(shí)內(nèi)完成）

 

二、測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 從-70℃取出待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解懸液樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)為540nm，并置零 
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
• 測(cè)定開始前，移出800微升底物液B（Reagent F）到新的1.5毫升離心管，加入200微升底物液A（Reagent E），混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為底物工作液（2次操作），放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作

 

• 標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定

 

• 準(zhǔn)備好5個(gè)2.2毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 分別加入1毫升緩沖液（Reagent C）到1至5號(hào)管
• 移取1毫升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1號(hào)管，混勻
• 小心移取1毫升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2號(hào)管，混勻
• 小心移取1毫升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3號(hào)管，混勻
• 小心移取1毫升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到4號(hào)管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

 

管號(hào)	緩沖液（Reagent C）	標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）	標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖濃度
1	1毫升	1毫升	15毫摩爾/升
2	1毫升	1毫升1號(hào)管	7.5毫摩爾/升
3	1毫升	1毫升2號(hào)管	3.75毫摩爾/升
4	1毫升	1毫升3號(hào)管	1.875毫摩爾/升
5	1毫升	0	0

 

• 分別移取500微升上述配制的系列標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1.5毫升離心管
• 分別加入500微升上述配制的底物工作液
• 在沸水里孵育5分鐘 ，避免光照
• 在室溫下靜置15分鐘冷卻，避免光照
• 分別移取100微升上述反應(yīng)液到新的比色皿
• 分別加入1毫升補(bǔ)充液（Reagent G），混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟8至14四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖濃度（毫摩爾/升）

 

• 樣品和背景測(cè)定

 

• 移取200微升緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
• 加入50微升待測(cè)樣品（100微克裂解萃取蛋白）或補(bǔ)充液（Reagent G）
• 25℃溫度下，孵育3分鐘
• 分別加入250微升反應(yīng)液（Reagent D），混勻
• 25℃溫度下，孵育3分鐘
• 分別加入500微升上述配制的底物工作液
• 在沸水里孵育5分鐘，避免光照
• 在室溫下靜置15分鐘冷卻，避免光照
• 分別移取100微升上述反應(yīng)液到新的比色皿
• 分別加入1毫升補(bǔ)充液（Reagent G），混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 實(shí)際樣品吸光讀數(shù)：樣品吸光讀數(shù)－背景吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)麥芽糖濃度（毫摩爾/升）
• 測(cè)算樣品酶活性：

 

【根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)麥芽糖濃度（毫摩爾/升）X樣品稀釋倍數(shù)】÷3 （反應(yīng)時(shí)間；分鐘）＝微摩爾MALTOSE/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾MALTOSE/毫克/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定
• 操作時(shí)，須戴手套
• 底物工作液注意避光
• 樣品檢測(cè)前，須溶解和澄清
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 測(cè)定值由低到高變化，表明有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• a-淀粉酶活性單位濃度定義：在25℃室溫下，pH 6.9的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）釋放1微摩爾的麥芽糖分子
• 本公司提供系列淀粉酶學(xué)分析技術(shù)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確

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