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                                                              English | 中文版 | 手機版 企業(yè)登錄 | 個人登錄 | 郵件訂閱
                                                              當前位置 > 產(chǎn)品目錄 > 實驗耗材 > 其他實驗耗材 > 組織半胱氨酸蛋白酶-8活性比色法定量檢測
                                                              組織半胱氨酸蛋白酶-8活性比色法定量檢測
                                                              英文名稱:QQ 2851717098總訪問:191
                                                              國產(chǎn)/進口:國產(chǎn)半年訪問:16
                                                              產(chǎn)地/品牌:上海一基產(chǎn)品類別:其他實驗耗材
                                                              規(guī)       格:48T 96T 最后更新:2024-12-3
                                                              貨       號:電話 021-6111 9791
                                                              參考報價:電詢
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                                                              • 產(chǎn)品介紹
                                                              • 公司簡介

                                                              組織半胱氨酸蛋白酶-8活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)

                                                              主要用途

                                                              組織半胱氨酸蛋白酶-8活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過四肽化合物底物Ac-IETD-pNA受到半胱氨酸蛋白酶-8的水解,釋放黃色硝基苯胺,即采用比色法來測定組織裂解萃取樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品(動物、人體、昆蟲等)半胱氨酸蛋白酶-8(CASPASE-8)的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定。

                                                               

                                                              技術(shù)背景

                                                               

                                                              半胱氨酸蛋白酶(Cysteine-requiring Aspartate protease;CASPASE),或稱半胱天冬蛋白酶,是調(diào)節(jié)細胞凋亡的一類蛋白酶家屬。半胱氨酸蛋白酶-8(CASPASE-8;EC3.4.22.61)是半胱氨酸蛋白酶家屬中細胞凋亡誘導啟動蛋白(initiator)之一。其又稱FLICE(FADD like-interlukin-1 β-converting enzyme;FADD類白細胞介素-1β轉(zhuǎn)換酶)、MACH (MORT1-associated CED-3 homolog;MORT相關(guān)性秀麗隱桿線蟲細胞死亡基因數(shù)3同源體)和Mch5 (mammalian CED homolog 5;秀麗隱桿線蟲細胞死亡基因哺乳動物同源體5)等。半胱氨酸蛋白酶-8前體為55kd(470氨基酸),切離后激活而啟動細胞凋亡。通過間接與細胞膜受體發(fā)生聯(lián)系,將細胞膜信號傳遞轉(zhuǎn)化到細胞漿內(nèi)。其底物之一是多聚ADP-核糖多聚酶(poly(ADP-ribose)polymerase;PARP)等。半胱氨酸蛋白酶-8的活性檢測用來評價細胞或組織凋亡的啟動狀況,基于人工合成的四肽化合物底物Ac-IETD-pNA(acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp-p-Nithoaniline;乙酰異亮氨酰谷氨酰蘇氨酰天冬氨酰硝基苯胺)受到半胱氨酸蛋白酶-8的水解,釋放有色硝基苯胺(405nm 波長),來定量測定半胱氨酸蛋白酶-8的活性。半胱氨酸蛋白酶-8反應(yīng)系統(tǒng)為:

                                                               

                                                              CASPASE-8

                                                              Ac-IETD-pNA       →          Ac-IETD  +   pNA

                                                                                              (黃色)

                                                               

                                                              產(chǎn)品內(nèi)容

                                                               

                                                              清理液(Reagent A)  60毫升

                                                              裂解液(Reagent B)  10毫升

                                                              緩沖液(Reagent C)   2毫升

                                                              陰性液(Reagent D)     1毫升

                                                              底物液(Reagent E)   220微升

                                                              產(chǎn)品說明書      1份

                                                               

                                                              保存方式

                                                               

                                                              保存清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里;底物液(Reagent E)避免光照和反復(fù)凍融;有效保證6月

                                                               

                                                              用戶自備

                                                               

                                                              1.5毫升離心管:用于樣品制備和儲存的容器

                                                              15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

                                                              液氮罐:用于組織樣品深凍處理

                                                              微型臺式離心機:用于樣品沉淀

                                                              培養(yǎng)箱:用于反應(yīng)物孵育

                                                              100微升1厘米光徑比色皿或96孔板:用于樣品比色測定的容器

                                                              分光光度儀或酶標儀:用于樣品比色分析

                                                               

                                                              實驗步驟

                                                               

                                                              實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的底物液(Reagent E)置入冰槽里融化,避免光照。然后進行下列操作。

                                                               

                                                              • 樣品制備

                                                               

                                                              • 手術(shù)取出動物組織,并秤重以確定500毫克組織重量 
                                                              • (選擇步驟)放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
                                                              • (選擇步驟)加入3毫升清理液(Reagent A清洗1次
                                                              • 移入到一個液氮凍存管
                                                              • 即刻放進液氮罐過夜
                                                              • 次日從液氮罐里取出,即刻(最快速度)用研磨棒碾碎組織成粉末狀(注意:切莫使組織凍融
                                                              • 放進一個15毫升錐形離心管
                                                              • 加入置于冰槽里的500微升裂解液(Reagent B 
                                                              • 強力渦旋震蕩30秒,充分混勻
                                                              • 放進冰槽里孵育30分鐘,期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒(注意:如需暫時停止,放進-70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/em>)
                                                              • 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如EPPENDORF 5415D)
                                                              • 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
                                                              • 移取5微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-30030.1
                                                              • 放進-70℃的冰箱里備用
                                                              • 或放進冰槽里,繼續(xù)后續(xù)操作

                                                               

                                                              • 測定準備

                                                               

                                                              • 準備好藥物處理的待測樣品
                                                              • 設(shè)定好酶標儀(溫度為37℃):波長405nm,并置零 

                                                               

                                                              • 活性測定

                                                               

                                                              • 在96孔板上做好相應(yīng)標記:背景對照和樣品
                                                              • 分別移取85微升緩沖液(Reagent C到相應(yīng)孔里
                                                              • 分別加入5微升陰性液(Reagent D或上述制備的待測樣品(100微克總蛋白)到相應(yīng)孔里(注意:樣品須清澈
                                                              • 分別加入10微升底物液(Reagent E
                                                              • 輕輕搖動96孔板(注意:避免氣泡
                                                              • 在37℃溫度下孵育90分鐘(注意:可見反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見的黃色
                                                              • 即刻放進酶標儀檢測或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿,在分光光度儀里檢測
                                                              • 活性計算:

                                                               

                                                              • 酶標儀檢測

                                                               

                                                              [(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10(體系容量;毫升)]÷[0.005(樣品容量;毫升)X 10.5(毫摩爾吸光系數(shù))X 90 (反應(yīng)時間;分鐘)X 0.6(光徑距離;厘米)]=單位/分鐘/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/分鐘/毫克

                                                               

                                                              • 比色皿檢測

                                                               

                                                              [(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10(體系容量;毫升)]÷[0.005(樣品容量;毫升)X 10.5(毫摩爾吸光系數(shù))X 90 (反應(yīng)時間;分鐘)]=單位/分鐘/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/分鐘/毫克

                                                               

                                                              注意事項

                                                               

                                                              • 本產(chǎn)品為21次(96孔板)操作,包括背景對照
                                                              • 操作時,須戴手套
                                                              • 系統(tǒng)操作過程中,背景測定只需1次
                                                              • 樣品須澄清,且避免反復(fù)凍融 
                                                              • 反應(yīng)90分鐘后比色測定值通常升高達0.2以上
                                                              • 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/5微升;如果樣本酶活性過低,即90分鐘讀數(shù)過低,則可以延長反應(yīng)孵育時間至16小時;其次增加樣本量(本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1)
                                                              • 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度
                                                              • 半胱氨酸蛋白酶-8單位活性定義為:在25℃,pH 7.4條件下,每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾四肽化合物底物Ac-IETD-pNA所需的酶量作為一個活性單位
                                                              • 本公司提供系列半胱氨酸蛋白酶-8酶學檢測試劑產(chǎn)品

                                                               

                                                              質(zhì)量標準

                                                               

                                                              • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
                                                              • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
                                                              bio-equip.com
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