組織半胱氨酸蛋白酶-8活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

組織半胱氨酸蛋白酶-8活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過四肽化合物底物Ac-IETD-pNA受到半胱氨酸蛋白酶-8的水解，釋放黃色硝基苯胺，即采用比色法來測定組織裂解萃取樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體、昆蟲等）半胱氨酸蛋白酶-8（CASPASE-8）的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

半胱氨酸蛋白酶（Cysteine-requiring Aspartate protease；CASPASE），或稱半胱天冬蛋白酶，是調(diào)節(jié)細胞凋亡的一類蛋白酶家屬。半胱氨酸蛋白酶－8（CASPASE-8；EC3.4.22.61）是半胱氨酸蛋白酶家屬中細胞凋亡誘導啟動蛋白（initiator）之一。其又稱FLICE（FADD like-interlukin-1 β-converting enzyme；FADD類白細胞介素-1β轉(zhuǎn)換酶）、MACH （MORT1-associated CED-3 homolog；MORT相關(guān)性秀麗隱桿線蟲細胞死亡基因數(shù)3同源體）和Mch5 （mammalian CED homolog 5；秀麗隱桿線蟲細胞死亡基因哺乳動物同源體5）等。半胱氨酸蛋白酶－8前體為55kd（470氨基酸），切離后激活而啟動細胞凋亡。通過間接與細胞膜受體發(fā)生聯(lián)系，將細胞膜信號傳遞轉(zhuǎn)化到細胞漿內(nèi)。其底物之一是多聚ADP-核糖多聚酶（poly（ADP-ribose）polymerase；PARP）等。半胱氨酸蛋白酶-8的活性檢測用來評價細胞或組織凋亡的啟動狀況，基于人工合成的四肽化合物底物Ac-IETD-pNA（acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp-p-Nithoaniline；乙酰異亮氨酰谷氨酰蘇氨酰天冬氨酰硝基苯胺）受到半胱氨酸蛋白酶-8的水解，釋放有色硝基苯胺（405nm 波長），來定量測定半胱氨酸蛋白酶-8的活性。半胱氨酸蛋白酶-8反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

CASPASE-8

Ac－IETD－pNA       →          Ac－IETD  +   pNA

                                （黃色）

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）   2毫升

陰性液（Reagent D）     1毫升

底物液（Reagent E）   220微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

液氮罐：用于組織樣品深凍處理

微型臺式離心機：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

100微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于樣品比色測定的容器

分光光度儀或酶標儀：用于樣品比色分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。然后進行下列操作。

 

• 樣品制備

 

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入置于冰槽里的500微升裂解液（Reagent B） 
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 放進冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/em>）
• 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 移取5微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 放進－70℃的冰箱里備用
• 或放進冰槽里，繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測定準備

 

• 準備好藥物處理的待測樣品
• 設(shè)定好酶標儀（溫度為37℃）：波長405nm，并置零 

 

• 活性測定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標記：背景對照和樣品
• 分別移取85微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
• 分別加入5微升陰性液（Reagent D）或上述制備的待測樣品（100微克總蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 分別加入10微升底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育90分鐘（注意：可見反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見的黃色）
• 即刻放進酶標儀檢測或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測
• 活性計算：

 

• 酶標儀檢測

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 90 （反應(yīng)時間；分鐘）X 0.6（光徑距離；厘米）]＝單位/分鐘/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/分鐘/毫克

 

• 比色皿檢測

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 90 （反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/分鐘/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/分鐘/毫克

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為21次（96孔板）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融 
• 反應(yīng)90分鐘后比色測定值通常升高達0.2以上
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/5微升；如果樣本酶活性過低，即90分鐘讀數(shù)過低，則可以延長反應(yīng)孵育時間至16小時；其次增加樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 半胱氨酸蛋白酶-8單位活性定義為：在25℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾四肽化合物底物Ac-IETD-pNA所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列半胱氨酸蛋白酶-8酶學檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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