冰凍切片半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性原位熒光染色檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

冰凍切片半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性原位熒光染色檢測試劑是一種旨在通過半胱氨酸蛋白酶-3抑制劑DEVD-FMK，與熒光染料FITC偶聯(lián)作為探針，自由進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，不可逆地結(jié)合活化的半胱氨酸蛋白酶-3，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明酶活性的變化，進(jìn)而分析細(xì)胞凋亡的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種冰凍組織內(nèi)半胱氨酸蛋白酶-3活性檢測�？梢员挥糜诩�(xì)胞凋亡、信號傳遞等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡易，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞遵循特定程序的自殺，一種進(jìn)化保留的形式。其程序的主要元素是蛋白水解酶，即半胱氨酸蛋白酶的瀑布式反應(yīng)：從激發(fā)凋亡信號，到酶的裂解活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞瓦解。半胱氨酸蛋白酶家屬是絲氨酸蛋白水解酶，其活化的酶由2個(gè)20Kd的大單體和2個(gè)10Kd的小單體組成2個(gè)異構(gòu)二聚體。半胱氨酸蛋白酶家屬分成三大分支：啟動(dòng)、擴(kuò)增和執(zhí)行。受體激活酶的啟動(dòng)，例如半胱氨酸蛋白酶-8（caspase-8）；啟動(dòng)性酶或線粒體分子激活擴(kuò)增反應(yīng)，例如半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9）；最后上游的酶激活下游的酶執(zhí)行，例如半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）。半胱氨酸蛋白酶特異性地識(shí)別目標(biāo)底物的4個(gè)氨基酸殘基，包括天門冬氨酸。使用熒光標(biāo)記的特異性底物可以探測半胱氨酸蛋白酶活性。綠色熒光標(biāo)記的抑制劑，F(xiàn)ITC-DEVD- FMK，是天冬氨酰-谷氨酰-纈氨酰-天冬氨酸（Aspaspartatylglutamyl valylaspartic acid；DEVD）熒光甲基酮（fluoromethyl ketone；FMK）的異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocynate；FITC）衍生物。該抑制劑進(jìn)入細(xì)胞后，與活化半胱氨酸蛋白酶的大單體上絲氨酸殘基二價(jià)共鍵結(jié)合，抑制半胱氨酸蛋白酶-3的活性，而未結(jié)合的熒光標(biāo)記彌散出胞外被洗脫。含有熒光標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行熒光定性或定量檢測。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

染色液（Reagent A）     25微升

稀釋液（Reagent B）     2.5毫升

清理液（Reagent C）     30毫升

固著液（Reagent D）     10毫升

產(chǎn)品說明書 1份

 

保存方式

 

保存染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制的容器

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于組織細(xì)胞熒光定性分析

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent B）室溫下預(yù)熱。然后移出2微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入200微升稀釋液（Reagent B），混勻后，室溫下靜置，并標(biāo)記為染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備4片待測的厚為10微米的未經(jīng)固著處理的冰凍切片（注意：建議使用異戊烷快速冷凍制片）
• 置于室溫下，小心加上200微升預(yù)冷的清理液（Reagent C），鋪滿整個(gè)切片表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent C）
• 小心加上50微升室溫預(yù)熱的含有染色液（Reagent A） 和稀釋液（Reagent B）的染色工作液，鋪滿整個(gè)切片表面
• 在37℃濕潤培養(yǎng)箱里，孵育60分鐘（注意：避免液體蒸發(fā)；可以蓋上蓋玻片孵育）
• 小心移去切片上的染色工作液，避免光照
• 小心加上200微升清理液（Reagent C），鋪滿整個(gè)切片表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent C）
• 小心加入200微升固著液（Reagent D）
• 室溫下（25℃），孵育15分鐘
• 小心移去固著液（Reagent D）
• 小心加上200微升清理液（Reagent C） 
• 小心移去 清理液（Reagent C）
• 放上蓋玻片或封片
• 即刻在共聚焦或倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察 ：濾波器激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm ――如果綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明半胱氨酸蛋白酶-3活性增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡陽性

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為50次（50微升工作液）操作
• 所有操作均須無菌狀態(tài)下進(jìn)行
• 操作時(shí)，須戴手套
• 建議使用正常組織切片作為陰性對照，顯示微弱的背景信號
• 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析
• 孵育時(shí)，必須避免光照
• 本公司提供系列半胱氨酸蛋白酶熒光染色分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

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