細(xì)胞乙�；�組蛋白H3染色質(zhì)免疫沉淀分析試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）

主要用途

細(xì)胞乙�；�組蛋白H3染色質(zhì)免疫沉淀分析（CHIP）試劑是一種旨在通過(guò)甲醛交聯(lián)、物理或化學(xué)處理細(xì)胞核以及染色質(zhì)，從而運(yùn)用特異抗體結(jié)合免疫沉淀，然后萃取DNA，擴(kuò)增分析，來(lái)確定乙�；�組蛋白H3結(jié)合蛋白的目標(biāo)DNA序列的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于后續(xù)組蛋白H3乙�；瘓D譜的微陣列分析。廣泛應(yīng)用于體內(nèi)定性檢測(cè)各種動(dòng)物細(xì)胞與乙�；�組蛋白H3相關(guān)的活性基因或DNA結(jié)合序列以及組蛋白H3乙酰化和DNA的相互作用等。產(chǎn)品即到即用，抗體配置，性能穩(wěn)定，操作便捷，反應(yīng)敏感，結(jié)合顯著，重復(fù)性好。

 

技術(shù)背景

 

DNA和蛋白質(zhì)的相互作用是調(diào)控細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程的要素之一。染色質(zhì)免疫沉淀分析方法（chromatin immunoprecipitation；CHIP）是研究活體內(nèi)（in vivo）DNA和蛋白質(zhì)的相互作用的最新最有力的工具：用于分析染色質(zhì)結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、以及表觀遺傳學(xué)變異等。CHIP技術(shù)通過(guò)三大步驟實(shí)現(xiàn)：第一，甲醛固定后染色質(zhì)分離和斷片；第二，運(yùn)用特異蛋白之抗體，免疫共沉淀結(jié)合蛋白（包括轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶、組蛋白等）的染色質(zhì)片斷；第三，分析目標(biāo)DNA和蛋白的修飾。其中轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)節(jié)蛋白，通過(guò)結(jié)合核DNA，以達(dá)到控制基因表達(dá)。組蛋白是高度保守的核蛋白，作為核DNA組織成染色質(zhì)的框架。組蛋白的轉(zhuǎn)譯后修飾，包括乙�；�、磷酸化、甲基化、ADP核糖基化（ADP ribosylation）和泛素化（Ubiquitination）等，幫助調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、重組和復(fù)制等。由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶催化的組蛋白乙�；�修飾發(fā)生在多個(gè)保守賴氨酸的氨基基團(tuán)。組蛋白H3乙�；�是染色體的表觀遺傳標(biāo)記，作用于調(diào)控各種細(xì)胞生理過(guò)程，包括基因轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)組裝、細(xì)胞繁殖、以及腫瘤形成等。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A） 300毫升

固著液（Reagent B）      100毫升

終止液（Reagent C）       10毫升

裂解液（Reagent D）  50毫升

核溶液（Reagent E）  10毫升

稀釋液（Reagent F）  10毫升

結(jié)合液（Reagent G）   1毫升

抗體液（Reagent H） 500微升

低鹽液（Reagent I）  10毫升

高鹽液（Reagent J）  10毫升

平衡液（Reagent K）  10毫升

緩沖液（Reagent L）  22毫升

洗脫液（Reagent M）       10毫升

解聯(lián)液（Reagent N）  1.2毫升

酶解液（Reagent O） 100微升

萃取液（Reagent P）  10毫升

濃縮液（Reagent Q）        3毫升

沉淀液（Reagent R）  25毫升

凈化液（Reagent S）  25毫升

擴(kuò)增液（Reagent T） 300微升

補(bǔ)充液（Reagent U）   1毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書       1份

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent D）、核溶液（Reagent E）、稀釋液（Reagent F）、結(jié)合液（Reagent G）、抗體液（Reagent H）、解聯(lián)液（Reagent N）、酶解液（Reagent O）、萃取液（Reagent P）、濃縮液（Reagent Q）和擴(kuò)增液（Reagent T）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 有效保證6月

 

用戶自備

 

特異引物：用于目標(biāo)DNA的擴(kuò)增或測(cè)序

1.5毫升離心管：用于樣品反應(yīng)操作和保存的容器

2毫升離心管：用于樣品反應(yīng)操作和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離細(xì)胞

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

震蕩器：用于混勻反應(yīng)物

4℃微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀樣品

4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀樣品

平式搖蕩儀或搖床：用于孵育和混勻反應(yīng)

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細(xì)胞

超聲儀：用于裂解組織細(xì)胞核

PCR儀：用于擴(kuò)增反應(yīng)

電泳儀：用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，準(zhǔn)備好待測(cè)細(xì)胞的預(yù)處理：藥物處理等。同時(shí)將－20℃保存的試劑置于冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 細(xì)胞核分離

 

（一）貼壁細(xì)胞核分離

 

• 準(zhǔn)備100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿或75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞，直至生長(zhǎng)到80至90％鋪滿率（1 X 10⁷細(xì)胞）
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）小心加入10毫升清理液（Reagent A），鋪滿生長(zhǎng)表面
• （選擇步驟）小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入10毫升室溫預(yù)熱的固著液（Reagent B）
• 置于搖床，室溫下（25℃）孵育15分鐘，速度為50RPM
• 加入1毫升室溫預(yù)熱的終止液（Reagent C）
• 繼續(xù)置于搖床，室溫下（25℃）孵育5分鐘，速度為50RPM
• 小心抽去含有終止液（Reagent C）的固著液（Reagent B）
• 小心加入10毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），鋪滿生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 即刻用細(xì)胞刮脫棒刮脫細(xì)胞
• 轉(zhuǎn)移到15毫升錐形離心管
• 加入5毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟14至16一次
• 加入5毫升預(yù)冷的裂解液（Reagent D），混勻
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育10分鐘
• （選擇步驟）即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• （選擇步驟）在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約5下）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)8）
• （選擇步驟）將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心抽去上清液 
• 加入1毫升核溶液（Reagent E），混勻顆粒群
• 置于冰槽里孵育10分鐘
• 置于200瓦超聲儀下，功率50％，猝擊20秒，間隙10秒冷卻，重復(fù)3次（注意：根據(jù)DNA片段大小，增加超聲次數(shù)）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液分裝到10個(gè)2毫升離心管（100微升/管）
• 其中： 1）選擇1管進(jìn)行1：50稀釋后，測(cè)定OD260，確定DNA含量，使所有樣品的檢測(cè)濃度調(diào)整一致（注意：建議OD260＝0.1為佳）

2）或選擇1管進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)，使所有樣品的檢測(cè)濃度調(diào)整一致（注意：蛋白總量1至5毫克為佳；建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

3）或選擇1管進(jìn)行去交聯(lián)以及電泳鑒定超聲處理的DNA片段（0.3至1.5kb）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)9）

• 選擇1管繼續(xù)后續(xù)操作，其余的保存在－70℃冰箱里
• 加入900微升稀釋液（Reagent F）
• 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)步驟二繼續(xù)

 

（二）懸浮細(xì)胞核分離

 

• 準(zhǔn)備75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的懸浮細(xì)胞（1 X 10⁷細(xì)胞）
• 轉(zhuǎn)移到50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升室溫預(yù)熱的固著液（Reagent B），混勻
• 平放置于搖床，室溫下（25℃）孵育15分鐘，速度為100RPM
• 加入500微升室溫預(yù)熱的終止液（Reagent C）
• 繼續(xù)平放置于搖床，室溫下（25℃）孵育5分鐘，速度為100RPM
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟14至16二次
• 加入5毫升預(yù)冷的裂解液（Reagent D），混勻
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育10分鐘
• （選擇步驟）即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• （選擇步驟）在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約5下）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)8）
• （選擇步驟）將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心抽去上清液 
• 加入1毫升核溶液（Reagent E），混勻顆粒群
• 置于冰槽里孵育10分鐘
• 置于200瓦超聲儀下，功率50％，猝擊20秒，間隙10秒冷卻，重復(fù)3次（注意：根據(jù)DNA片段大小，增加超聲次數(shù)）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液分裝到10個(gè)2毫升離心管（100微升/管）
• 其中： 1）選擇1管進(jìn)行1：50稀釋后，測(cè)定OD260，確定DNA含量，使所有樣品的檢測(cè)濃度調(diào)整一致（注意：建議OD260＝0.1為佳）
  • 或選擇1管進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)，使所有樣品的檢測(cè)濃度調(diào)整一致（注意：蛋白總量1至5毫克為佳；建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

3）或選擇1管進(jìn)行去交聯(lián)以及電泳鑒定超聲處理的DNA片段（0.3至1.5kb）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)9）

• 選擇1管繼續(xù)后續(xù)操作，其余的保存在－70℃冰箱里
• 加入900微升稀釋液（Reagent F）
• 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)步驟二繼續(xù)

 

• 結(jié)合反應(yīng)

 

• 加入60微升結(jié)合液（Reagent G）
• 平放置于4℃搖床孵育1小時(shí)，速度為100RPM
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到2個(gè)新的2毫升離心管（每管500微升：1管為無(wú)抗體對(duì)照；1管為抗體處理管）
• 加入50微升抗體液（Reagent H）到抗體處理管
• 將對(duì)照和抗體管平放置于4℃搖床孵育16小時(shí)，速度為100RPM
• 加入40微升結(jié)合液（Reagent G）到抗體處理管
• 將對(duì)照和抗體管平放置于4℃搖床孵育2小時(shí)，速度為100RPM
• 將抗體管放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升低鹽液（Reagent I）到抗體管，混勻
• 平放置于4℃搖床孵育5分鐘，速度為100RPM
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升高鹽液（Reagent J）到抗體管，混勻
• 平放置于4℃搖床孵育5分鐘，速度為100RPM
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升平衡液（Reagent K）到抗體管，混勻
• 平放置于4℃搖床孵育5分鐘，速度為100RPM
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升緩沖液（Reagent L）到抗體管，混勻
• 平放置于4℃搖床孵育5分鐘，速度為100RPM
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟23至26一次
• 加入250微升洗脫液（Reagent M）到抗體管，混勻（注意：如果洗脫液（Reagent M）為乳白色，使用前，須溫育至澄清，才可使用）
• 平放置于搖床，室溫下孵育15分鐘，速度為100RPM
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心3分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的2毫升離心管
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟28至31一次
• 小心移取上清液合并到上述2毫升離心管（注意：可以暫時(shí)停止，存放在－20℃，次日繼續(xù)）

 

• DNA萃取

 

• 分別加入50微升解聯(lián)液（Reagent N）到抗體處理管和無(wú)抗體對(duì)照管，混勻
• 置于65℃恒溫水槽孵育2小時(shí)
• 分別加入5微升酶解液（Reagent O）
• 置于55℃恒溫水槽孵育2小時(shí)
• 室溫下靜置15分鐘
• 分別加入500微升萃取液（Reagent P）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 分別移出450微升上層液相溶液到2個(gè)新的2毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 分別加入150微升濃縮液（Reagent Q）到新的離心管
• 分別加入1.2毫升沉淀液（Reagent R）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式微型離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標(biāo)記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 分別加入1毫升凈化液（Reagent S）
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 分別加入50微升緩沖液（Reagent L）
• 溶解后放進(jìn)－20℃冰箱保存

 

• PCR擴(kuò)增

 

• 將擴(kuò)增液（Reagent T）和補(bǔ)充液（Reagent U）從－20℃冰箱里取出
• 置入冰槽里直至融化
• 針對(duì)一個(gè)樣本，每次移出15微升擴(kuò)增液（Reagent T）到PCR管
• 加入2微升上述結(jié)合實(shí)驗(yàn)中獲得的DNA樣品（總量100納克）
• 分別加入1微升用戶自備的特異性的引物F和引物R（各350納克或25微摩爾）
• 再加入7微升補(bǔ)充液（Reagent U）（反應(yīng)總量為25微升）
• 即刻放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
• 加入50微升PCR級(jí)礦物油（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)10）
• 即刻進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)：

 

溫度（℃）	時(shí)間	循環(huán)
95	2分鐘	1
95 Tm 72	30秒 1分鐘 30秒	35
72	5分鐘	1

 

• 反應(yīng)完畢后，移取5微升進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳
• 如果進(jìn)行測(cè)序鑒定，膠回收PCR產(chǎn)物（建議使用高質(zhì)純化一步法膠回收試劑盒；20051.1）
• 分別移出2微升反應(yīng)液到2個(gè)不同的新的1.5毫升離心管（每微升100納克）
• 加入1微升用戶自備的特異性巢式引物F（每微升350納克）到其中一個(gè)1.5毫升離心管，作好標(biāo)記
• 加入1微升用戶自備的特異性巢式引物R（每微升350納克）到另一個(gè)1.5毫升離心管，作好標(biāo)記
• 進(jìn)行后續(xù)的直接測(cè)序反應(yīng)

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為10次（1 X 10⁷細(xì)胞/次）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 如果使用胰酶脫離貼壁細(xì)胞，脫離后按照懸浮細(xì)胞核分離步驟操作
• 抗體液（Reagent H）是特異性兔多克隆抗乙�；�組蛋白H3抗體，可以識(shí)別17kDa的乙�；�組蛋白；避免反復(fù)凍融
• 固著處理必須在室溫下進(jìn)行，其余的操作均須在4℃狀態(tài)進(jìn)行
• 嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行
• 建議使用無(wú)抗體對(duì)照
• 通常勻化次數(shù)為80下達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常超聲處理后的DNA片段大小為0.3至1.5kb；如果使片段小于1.0kb，增加超聲次數(shù)或功率即可。電泳鑒定前，加入10微升解聯(lián)液（Reagent N）到1管100微升超聲處理后樣品，65℃孵育4小時(shí)，移取20微升進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳。其標(biāo)準(zhǔn)片段電泳圖象如下：泳道1為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣；泳道2為未經(jīng)超聲處理樣品；泳道3為超聲處理后樣品；泳道4為強(qiáng)化超聲處理后樣品

 

• 根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 建議使用軟件測(cè)算Tm溫度；參考公式為Tm=4（G+C）+2（A+T）
• 在－20℃冰箱里儲(chǔ)存的產(chǎn)品避免反復(fù)凍融
• 本公司提供系列CHIP研究產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶

上海一基實(shí)業(yè)有限公司多年專供：ELISA試劑盒，PCR恒溫?zé)晒鉁y(cè)試盒、朗道校準(zhǔn)品、校準(zhǔn)質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品|對(duì)照品、抗體|抗原、生物試劑、動(dòng)物血清、人類CDNA、基因組DNA、MicroRNA產(chǎn)品、總RNA產(chǎn)品、人原代細(xì)胞裂解液、生物試劑、高端試劑等系列產(chǎn)品。如需產(chǎn)品詳細(xì)說(shuō)明等物理性質(zhì)信息請(qǐng)聯(lián)系客服為您查詢！質(zhì)量保證，價(jià)格優(yōu)惠，是國(guó)內(nèi)生物試劑權(quán)威的供應(yīng)商之一，專業(yè)經(jīng)銷生物科學(xué)領(lǐng)域的品牌試劑：Sigma試劑、ASROS試劑、AIFA試劑、alding試劑、Fisher試劑、日本MBL試劑、美國(guó)劍橋CIL氘代試劑、ATCC菌株等品牌產(chǎn)品。擁有齊全的生產(chǎn)和檢測(cè)設(shè)備，實(shí)施嚴(yán)格的管理制度和完善的質(zhì)量保證體系，為廣大客戶提供全面的技術(shù)支持和完善的售后服務(wù)。歡迎來(lái)電咨詢!