p16 ^INK4A蛋白表達西方雜交分析試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

 

主要用途

 p16 ^INK4A蛋白表達西方雜交分析試劑是一種旨在將細胞或組織中總蛋白懸液經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到固相膜上（如NC、PVDF等），經(jīng)過非特異結(jié)合位點的封閉處理， 進行辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的p16單克隆抗體與膜上的蛋白直接和間接（標(biāo)記二抗）反應(yīng)，然后加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑，經(jīng)X光片（放射自顯影片）感光記錄其免疫印跡，用以分析特定蛋白p16表達水平的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。其適用于p16 ^INK4A目標(biāo)蛋白的免疫學(xué)檢測。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，敏感度高，顯色清晰，重復(fù)性好。

 

技術(shù)背景

 

p16蛋白，又稱為細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制物蛋白4A（inhibitor of cyclin-dependent kinase 4a；INK4A/INK4）、細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制物蛋白2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A；CDKN2ACDK2）、可變讀框基因（alternative reading frame；ARF－p14^ARF，p19 ^ARF）、多腫瘤抑制基因（Multiple tumor suppressor 1；MTS1）等。p16蛋白為16Kd，基因定位于9號染色體上。其具有抑制激酶活性，抑制腫瘤細胞生長，同時在衰老細胞中表達增高。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

膠體液（Reagent A） 50毫升

促進液（Reagent B）     100微升

凝結(jié)液（Reagent C）  1毫升

聚積液（Reagent D） 25毫升

電泳液（Reagent E）     250毫升

上樣液（Reagent F）     500微升

轉(zhuǎn)印液（Reagent G）     125毫升

封阻液（Reagent H）     100毫升

清理液（Reagent I）     250毫升

一抗液（Reagent J）     100微升

二抗液（Reagent K）     100微升

發(fā)光液A（Reagent L） 50毫升

發(fā)光液B（Reagent M） 250微升

產(chǎn)品說明書       1份

 

保存方式

 

保存凝結(jié)液（Reagent C）、一抗液（Reagent J）和二抗液（Reagent K）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；發(fā)光液A（Reagent D），避免光照，有效保證6月

 

 

用戶自備

 

粗提細胞核蛋白（30023）或總蛋白（30002）懸液：待測樣品

低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣：用于定位目標(biāo)蛋白

無離子水：用于配制工作液

甲醇：用于轉(zhuǎn)印

1.5毫升離心管：用于蛋白樣品處理的容器

50毫升錐形離心管：用于溶液混勻的容器

500毫升容器瓶：用于配制工作液的容器

塑料盒或塑料袋：用于印跡膜操作的容器

蛋白電泳槽：用于蛋白分離電泳

電轉(zhuǎn)印儀：用于蛋白印跡轉(zhuǎn)移

平式震蕩儀：用于孵育和混勻反應(yīng)

PVDF固相膜：用于電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移的載體

保鮮膜：用于固相膜包裹

X光片：用于發(fā)光顯影

 

實驗步驟

 

• 凝膠制備

 

實驗開始前，移取50毫升電泳液（Reagent E）到500毫升容器瓶里，加入450毫升無離子水，混勻后，標(biāo)記為電泳工作液。然后進行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備1個50毫升錐形離心管
• 移出10毫升膠體液（Reagent A）
• 加入10微升促進液（Reagent B）
• 再加入100微升凝結(jié)液（Reagent C）
• 即刻搖動瓶身，混勻
• 移入準(zhǔn)備好的玻璃槽里，預(yù)留頂端1至1.5厘米空間，避免氣泡
• 在室溫下，靜置15至45分鐘，直到膠體凝結(jié)
• 移出5毫升聚積液（Reagent D）到50毫升錐形離心管里
• 加入5微升促進液（Reagent B）
• 再加入50微升凝結(jié)液（Reagent C）
• 即刻搖動瓶身，混勻
• 移入到已有膠體凝結(jié)的玻璃槽上端，避免氣泡
• 小心插入10或15孔梳
• 在室溫下，靜置15至45分鐘，直到膠體凝結(jié)
• 加入適量的含有電泳液（Reagent E）的電泳工作液到電泳槽里
• 小心取出10或15孔梳
• 用電泳工作液清洗樣品孔

 

二、蛋白電泳

• 從－80℃冰箱里取出待測可溶性總蛋白或核蛋白懸液，置于冰槽里融化（注意：懸液須澄清）
• 移取10微升懸液（蛋白總量為25至50微克）到1.5毫升離心管
• 加入10微升上樣液（Reagent F），混勻
• 煮沸5分鐘
• 小心加入20微升上述樣品到相應(yīng)的樣品孔里，包括用戶自備的低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣
• 連接電極，打開電源
• 電泳運行3小時或染料峰沿到達距離膠底1厘米處，電壓為150伏

 

• 轉(zhuǎn)印

• 出25毫升轉(zhuǎn)印液（Reagent G）到250毫升容量瓶里
• 加入50毫升甲醇
• 加入175毫升無離子水，充分混勻后，標(biāo)記為轉(zhuǎn)印工作液，放進4℃冰箱里預(yù)冷
• 拆除電泳裝置，取出電泳玻璃板塊
• 分離玻璃板快，切除堆積膠體部分（STACKING GEL）
• 將分離膠體（RESOLVING GEL）浸泡在預(yù)冷的100毫升轉(zhuǎn)印工作液
• 剪下用戶自備的5 cm X 8 cm PVDF轉(zhuǎn)印膜
• 加入適量的用戶自備的無水甲醇浸濕PVDF轉(zhuǎn)印膜
• 取出PVDF膜，放進50毫升轉(zhuǎn)印工作液
• 用剩下的100毫升轉(zhuǎn)印工作液使過濾紙濕潤
• 組成三明治結(jié)構(gòu)進行濕潤轉(zhuǎn)�。╓ET TRANSFER）
• 或在4℃溫度下進行電轉(zhuǎn)印過夜運行：電壓50伏，電流150-200毫安或運行3至4小時，電壓：50伏，電流為400毫安

 

四、封阻

• 移出20毫升封阻液（Reagent H）到100毫升容量瓶里（注意：使用前，室溫預(yù)熱，搖勻封阻液）
• 加入80毫升無離子水，充分混勻后，標(biāo)記為封阻工作液
• 移出50毫升清理液（Reagent I）到500毫升容量瓶里
• 加入450毫升無離子水，充分混勻后，標(biāo)記為清理工作液
• 將5 X 8 cm²的PVDF固相膜放進塑料盒里
• 加入75毫升封阻工作液
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育45分鐘
• 小心倒掉封阻工作液
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育5分鐘
• 小心倒掉清理工作液
• 重復(fù)實驗步驟9至11一次

 

五、結(jié)合

• 將固相膜放進塑料袋里或塑料盒里
• 加入10毫升封阻工作液
• 加入20微升一抗液（Reagent J），混勻 
• 將塑料袋封口或蓋上塑料盒
• 確保液體鋪滿整個固相膜表面
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育60分鐘
• 取出固相膜，放進新的塑料盒
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育5分鐘
• 移去清理工作液
• 重復(fù)實驗步驟8至10三次
• 將固相膜放進新的塑料袋里或塑料盒里
• 加入10毫升封阻工作液
• 加入20微升二抗液（Reagent K），混勻
• 將塑料袋封口或蓋上塑料盒
• 確保液體鋪滿整個固相膜表面
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育60分鐘
• 取出固相膜，放進塑料盒
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育5分鐘
• 移去清理工作液
• 重復(fù)實驗步驟19至21三次

 

六、顯影

 

實驗開始前，將4℃冰箱里的試劑盒中的發(fā)光液A（Reagent L）和發(fā)光液B（Reagent M） 置入室溫下，移出10毫升發(fā)光液A（Reagent L）到15毫升錐形離心管，加入30微升發(fā)光液B（Reagent M），混勻后，標(biāo)記為發(fā)光工作液，用錫箔紙包裹，避免光照。然后進行下列操作。

 

• 加入8至10毫升室溫預(yù)熱的發(fā)光工作液，鋪滿整個固相膜表面
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育1分鐘
• 用鑷子夾起固相膜，一角放在吸水紙上，吸干發(fā)光液
• 用保鮮膜塑料紙包住
• 置于X光片夾，曝光10秒至15分
• 洗印

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為5次操作（50個樣品）
• 操作時，須戴手套
• 孵育時，避免光照
• 半干式電轉(zhuǎn)印，運行1小時，電壓為15至20伏
• 轉(zhuǎn)印工作液建議在4℃冰箱里預(yù)冷
• 曝光時間需根據(jù)情況調(diào)整
• 本公司系列細胞衰老技術(shù)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能長期穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯影清晰

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