谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白活化凝血因子10（Factor Xa）完全酶切試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

 

主要用途

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白活化凝血因子10（Factor Xa）完全酶切試劑是一種旨在通過活化凝血因子10的特異作用序列，達(dá)到重組表達(dá)目標(biāo)多肽與融合克隆載體的分離，而獲得純化目標(biāo)蛋白，同時滅活活化凝血因子10殘留作用的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種pGEX X表達(dá)載體上融合或標(biāo)記在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶上目標(biāo)蛋白的分離純化。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，分離效率高。

 

技術(shù)背景

 

研究編碼蛋白首先通過重組DNA技術(shù)在細(xì)菌中表達(dá)，其中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白系統(tǒng)有效地幫助目的基因獲得高表達(dá)的目標(biāo)蛋白。目的基因被引入到細(xì)菌中高度表達(dá)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因，利用該基因的表達(dá)系統(tǒng)，避免了翻譯過程中影響表達(dá)的各種因素，從而得到滿意的表達(dá)產(chǎn)物。凝血因子10（Factor X）是一種位點特異性內(nèi)切蛋白酶（endoproteiase），優(yōu)先切離羧基末端肽鍵。其來自于牛血清分離，經(jīng)過羅素蝰蛇毒（Russell’s viper venom）激活處理而活化，分子量為48Kd，其切離序列為Ile-(Glu /Asp)-Gly-Arg四肽后的任何氨基酸（除Arg或Pro外），出現(xiàn)在大多數(shù)表達(dá)載體上，便于獲取目標(biāo)蛋白。 

  

產(chǎn)品內(nèi)容

 

緩沖液（Reagent A）  15毫升

酶解液（Reagent B）      100微升

終止液（Reagent C）  50微升

產(chǎn)品說明書       1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)操作和保存樣本的容器

平式搖蕩儀：用于混勻反應(yīng)物

微型臺式離心機：用于沉淀反應(yīng)物

 

實驗步驟

 

實驗開始前，準(zhǔn)備好GST樹脂純化操作，直至洗脫處理前；同時將試劑從－20℃冰箱里取出，在冰槽里融化。然后進行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備1個1.5毫升離心管
• 移入已經(jīng)含有目標(biāo)蛋白結(jié)合處理的GST樹脂（注意：未經(jīng)洗脫處理）
• 或直接使用剛剛操作的GST樹脂（注意：未經(jīng)洗脫處理）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升緩沖液（Reagent A）
• 輕柔渦旋震蕩5秒，混勻
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升緩沖液（Reagent A）
• 加入10微升酶解液（Reagent B）
• 輕柔渦旋震蕩5秒，混勻
• 放進22℃恒溫水槽孵育16小時
• 或平放在平式搖蕩儀上，在22℃溫度下孵育16小時，速度為50RPM
• 加入5微升終止液（Reagent C）
• 放進20℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
• 小心移取上清液到預(yù)冷的新的1.5毫升離心管
• （選擇步驟）加入250微升緩沖液（Reagent A），混勻
• （選擇步驟）放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3500g
• （選擇步驟）小心移取上清液合并到上述1.5毫升離心管
• 即刻放進－70℃冰箱里保存
• 或移取2至5微升進行SDS-PAGE電泳鑒定目標(biāo)蛋白片段

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為10次操作
• 本產(chǎn)品可用于HIS標(biāo)記的融合蛋白分離
• 操作時，須戴手套
• 酶解液（Reagent B）避免反復(fù)凍融，建議分裝
• 酶解液（Reagent B）的切離能力取決于融合蛋白的三維結(jié)構(gòu)、序列位置等各種因素；通常10微升即5單位酶解液（Reagent B）可以切離500微克目標(biāo)蛋白，其酶切效率可達(dá)90% 
• 增加切離能力的方法是：測試各種濃度的酶解液（Reagent B）、孵育溫度（4至37℃）和孵育時間（2至16小時）
• 避免樣品中含有PMSF、DTT、Urea、guanidine、Imidazole、SDS等
• 避免過量使用酶解液（Reagent B）
• 如果純化效果欠佳，建議使用Thrombin（ GST融合蛋白Thrombin酶切試劑盒-30070.2）、或protease（ GST融合蛋白protease酶切試劑盒-30070.1）等酶切
• 本公司提供系列融合蛋白處理試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離效果滿意

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