氨基萘三磺酸（ANTS）標(biāo)記熒光輔助糖分子電泳（FACE）檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）

 

主要用途

 

氨基萘三磺酸（ANTS）標(biāo)記熒光輔助糖分子電泳（FACE）檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)熒光探針氨基萘三磺酸和糖分子的末端醛基的結(jié)合，經(jīng)過(guò)凝膠電泳顯示的熒光條帶，來(lái)識(shí)別和定量糖分子成分和豐度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心改良傳統(tǒng)方法、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于各種寡聚糖的分離檢測(cè)。產(chǎn)品即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，熒光清晰，高度敏感。

 

技術(shù)背景

 

熒光輔助糖分子電泳（Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis；FACE）是一種通過(guò)熒光染料，標(biāo)記在糖分子上，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，依據(jù)分子量的大小，高度分離寡聚糖糖分子，識(shí)別和定量寡聚糖中單糖分子的檢測(cè)系統(tǒng)，以分析寡聚糖的特性、變化程度和單糖成分組成。氨基萘三磺酸（8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulphonate；ANTS）是一種具有高度電荷的熒光染料（激發(fā)波長(zhǎng)320nm，散發(fā)波長(zhǎng)520nm），與糖分子的末端醛基（aldehyde）結(jié)合，便于在凝膠電泳上清晰顯示，高度敏感，可以檢測(cè)到2皮摩爾的糖分子。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

標(biāo)記液（Reagent A）    5管

稀釋液（Reagent B）       500微升

反應(yīng)液（Reagent C）    5管

溶解液（Reagent D）       500微升

上樣液（Reagent E）    1毫升

膠體液（Reagent F）  150毫升

凝結(jié)液（Reagent G）    4毫升

促進(jìn)液（Reagent H）  400微升

上膠液（Reagent I）   15毫升

電泳液（Reagent J）  250毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書    1份

 

保存方式

 

保存標(biāo)記液（Reagent A）、反應(yīng)液（Reagent C）和凝結(jié)液（Reagent G）在-20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品標(biāo)記操作的容器

15毫升錐形離心管：用于上膠體溶液配制的容器

50毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制的容器

500毫升燒杯：用于配制工作液的容器

無(wú)離子水：用于稀釋試劑溶液

恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育

離心濃縮儀：用于樣品干燥

電泳儀：用于糖分子電泳分離

UV自動(dòng)成像儀或PHOSPHORIMAGE：用于電泳染色記錄和分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品：10微克糖蛋白或30皮摩爾寡聚糖
• 如果檢測(cè)糖蛋白中的寡聚糖分子，建議使用生物酶法分離寡聚糖分子
• 如果檢測(cè)糖蛋白或寡聚糖中的單糖分子，建議使用肼解法：即使用2摩爾TFA水解中性糖分子或使用4摩爾鹽酸水解氨基糖分子

 

• 熒光標(biāo)記

 

實(shí)驗(yàn)開始前，從-20冰箱里分別取出1管標(biāo)記液（Reagent A）和反應(yīng)液（Reagent C），置于室溫下均衡。移取20微升稀釋液（Reagent B）到標(biāo)記液（Reagent A）管里，混勻，標(biāo)記為標(biāo)記工作液，避免光照；移取40微升溶解液（Reagent D）到反應(yīng)液（Reagent C）管里，混勻，標(biāo)記為反應(yīng)工作液，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 移取100微升待測(cè)樣品（10微摩爾/升）到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)離心濃縮儀離心干燥
• 加入5微升標(biāo)記工作液
• 加入5微升反應(yīng)工作液
• 用20微升槍頭抽吸混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育16小時(shí)，避免光照
• 放進(jìn)離心濃縮儀離心干燥
• 即刻加入50微升上樣液（Reagent E），混勻
• （選擇步驟）如果暫時(shí)停止，可以保存在-70℃冰箱里
• 繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 垂直電泳分析

 

• 移出30毫升膠體液（Reagent F）到50毫升錐形離心管里
• 加入600微升凝結(jié)液（Reagent G）
• 加入60微升促進(jìn)液（Reagent H）
• 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
• 在室溫下孵育45分鐘，或直至膠體凝結(jié)
• 移出3毫升上膠液（Reagent I）到15毫升錐形離心管里
• 加入100微升凝結(jié)液（Reagent G）
• 加入10微升促進(jìn)液（Reagent H）
• 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
• 插入10孔梳
• 在室溫下孵育45分鐘，或直至膠體凝結(jié)
• 移取50毫升電泳液（Reagent J）到500毫升容器里，加入450毫升用戶自備的無(wú)離子水，混勻后，標(biāo)記為電泳工作液
• 加入適量的電泳工作液到電泳槽里
• 拔出10孔梳
• 用1毫升槍頭清洗樣品孔槽
• 上樣：10微升（注意：20皮摩爾/微升）
• 在4℃環(huán)境下電泳3小時(shí)，穩(wěn)定電流為15毫安，直至溴酚藍(lán)（Bromophenol Blue）染料移動(dòng)到膠體下三分之二處
• 拆除電泳裝置，取出電泳玻璃板塊
• 分離玻璃板快，切除膠底
• 即刻置于UV自動(dòng)成像儀或PHOSPHORIMAGE下成像記錄，并測(cè)算條帶熒光強(qiáng)度
• 根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的上樣濃度和熒光強(qiáng)度，計(jì)算樣品的寡聚糖或單糖含量和相對(duì)豐度（relative abundance）

 

• 單糖濃度

 

[（待測(cè)樣品熒光強(qiáng)度 X樣品稀釋倍數(shù)）÷已知標(biāo)準(zhǔn)樣品熒光強(qiáng)度] X已知標(biāo)準(zhǔn)樣品上樣濃度（皮摩爾/微升）

 

• 單糖含量

 

根據(jù)單糖分子量換算成微克

 

• 寡聚糖

 

累加所有單糖的含量得出糖蛋白中的寡聚糖總量

 

4）計(jì)算百分比

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為5次操作（包括20次標(biāo)記，5次電泳）
• 操作時(shí)，須戴手套
• 建議樣品上樣量為200皮摩爾/10微升
• 標(biāo)記工作液和反應(yīng)工作液配制后，可以保存在-70℃冰箱里2周；使用前，如果有結(jié)晶析出，可以溫育溶解
• 用戶可以使用牛胎球蛋白（bovine fetuin）作為糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照
• 用戶可以使用N-乙酰乳糖胺（N-acetyllactosamine）、甘露糖（mannose）、巖藻糖（fucose）、半乳糖（galactose）、葡萄糖（glucose）等任何一個(gè)或組合作為單糖分子標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照
• 通常恒定電流15毫安運(yùn)行3至6小時(shí)；30毫安運(yùn)行1.5至3小時(shí)，但是膠體大小等因素會(huì)影響實(shí)際運(yùn)行時(shí)間；建議根據(jù)示蹤染料的位置決定是否終止電泳
• 通常電泳的電壓變化由100伏至1000伏范圍
• 本公司提供系列糖蛋白分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

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