可溶性真菌/酵母細(xì)胞膜蛋白（粗提）制備試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

可溶性真菌/酵母細(xì)胞膜蛋白（粗提）制備試劑是一種旨在使用生物、化學(xué)和物理方法相結(jié)合，有效去除真菌/酵母細(xì)胞壁，進(jìn)一步快速且充分裂解真菌/酵母細(xì)胞，并在蛋白酶抑制混合劑的幫助下，通過超速離心，分離并收集所有細(xì)胞膜可溶性蛋白質(zhì)的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的�？芍苯佑糜诤罄m(xù)蛋白電泳（SDS-PAGE）、西方雜交（Western blotting）、免疫沉淀（immunoprecipitation）、酶活性分析（enzymatic activity analysis）、蛋白質(zhì)相互作用分析（protein-protein interaction）、特異性表達(dá)識別（specific expression identification）和質(zhì)譜分析等。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，萃取產(chǎn)量和純度皆佳。

 

技術(shù)背景

 

通過多種特殊裂解系統(tǒng)和蛋白酶抑制混合劑可以防止裂解后細(xì)胞內(nèi)各種活性蛋白成分遭到活化內(nèi)源性蛋白酶的破壞，充分保留細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的免疫和生物學(xué)活性。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）       500毫升

平衡液（Reagent B）  500毫升

酶解液（Reagent C）    1毫升

裂解液（Reagent D）        10毫升

活性液（Reagent E）        50微升

GENEMD強(qiáng)化液（Reagent F）         1毫升

GENEMD保存液（Reagent G）        10毫升

產(chǎn)品說明書     1份

 

保存方式

 

保存酶解液（Reagent C）和活性液（Reagent E）在-20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶自備

 

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

臺式離心機(jī)：用于樣品操作

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

組織勻漿器：用于裂解真菌/酵母細(xì)胞

 

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent E）從－20℃的冰箱里取出，放進(jìn)冰槽里凍融，然后移出500微升裂解液（Reagent D）到1.5毫升離心管，加入2.5微升活性液（Reagent E），充分混勻，置于冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備好50毫升新鮮真菌/酵母樣品
• 在分光光度儀上測OD600為1（1 OD＝1 X 10⁷細(xì)胞/毫升；總量為5 X 10⁸細(xì)胞） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入25毫升清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）即刻放進(jìn)液氮罐過夜
• （選擇步驟）次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使菌體凍融）
• （選擇步驟）放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 加入50微升酶解液（Reagent C），混勻
• 放進(jìn)30℃恒溫水槽孵育60分鐘，期間每隔15分鐘輕輕用手搖勻
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)30℃恒溫水槽孵育30分鐘，繼續(xù)實驗步驟21
• 同時將平衡液（Reagent B）置入冰槽里預(yù)冷30分鐘
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的平衡液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升含有裂解液（Reagent D）和活性液（Reagent E）的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 選擇下列其中一種方法：

 

方法一：物理勻漿處理

 

• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化80下（注意：參見注意事項8）
• 將所有勻漿物移入1.5毫升離心管
• （選擇步驟）置于超聲波儀尖端，功率300瓦，20秒一次，冰上間隙1分鐘，連續(xù)8次
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• （選擇步驟）如果可見絲狀體，重復(fù)實驗步驟4至5一次（去除絲狀物）
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心30分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升保存液（Reagent G），混勻顆粒
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里備用
• 或放進(jìn)冰槽里，繼續(xù)各種后續(xù)（西方雜交、免疫沉淀等）操作

 

方法二：化學(xué)處理

 

1．在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次（注意：參見注意事項9）

• 加入預(yù)冷的50微升強(qiáng)化液（Reagent F）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次
• 將所有裂解物移入1.5毫升離心管
• （選擇步驟）置于超聲波儀尖端，功率300瓦，20秒一次，冰上間隙1分鐘，連續(xù)8次
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• （選擇步驟）如果可見絲狀體，重復(fù)實驗步驟7至8一次（去除絲狀物）
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心30分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升保存液（Reagent G），混勻顆粒
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里備用
• 或放進(jìn)冰槽里，繼續(xù)各種后續(xù)（西方雜交、免疫沉淀等）操作

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為20次（50毫升菌液）操作
• 操作時須戴手套
• 所有操作均須在4℃狀態(tài)下進(jìn)行
• 細(xì)胞生長切莫過度，否則影響蛋白表達(dá)和細(xì)胞裂解
• 50毫升（OD600＝1）菌液濕重約1克
• 活性液（Reagent E）避免反復(fù)凍融
• 本產(chǎn)品按照50毫升培養(yǎng)菌液配制。如果操作不同菌液容量，可相應(yīng)調(diào)整試劑用量，即100毫升菌液，1毫升裂解工作液；200毫升菌液，2毫升裂解工作液等
• 通常勻化次數(shù)為80下達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì)胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì)胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
• 50毫升（OD600＝1）菌液可獲得0.5毫克膜蛋白
• 建議使用物理法處理為首選；必要時使用酸珠裂解處理
• 如果產(chǎn)物得率過低，建議增加樣品量或使用其它裂解處理方法，例如French Press等
• 制備產(chǎn)物如果放在－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆�，�?yán)格避免反復(fù)凍融
• 本公司提供系列真菌/酵母試劑產(chǎn)品
    

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無蛋白酶污染

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