通用型蛋白免疫共沉淀（蛋白A樹(shù)脂）試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

通用型蛋白免疫共沉淀（蛋白A樹(shù)脂）試劑是一種旨在通過(guò)化學(xué)處理方法萃取并維護(hù)細(xì)胞或組織樣品中的蛋白復(fù)合物，從而運(yùn)用單一特異抗體結(jié)合免疫沉淀目標(biāo)蛋白以及與之相互作用的結(jié)合蛋白，然后由蛋白質(zhì)A（PROTEIN-A）樹(shù)脂捕獲抗原抗體復(fù)合物，洗脫產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)分析的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于后續(xù)蛋白電泳分析、西方（WESTERN BLOT）雜交檢測(cè)和蛋白多肽序列分析等。廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用、生化特征、酶活性、后轉(zhuǎn)錄修飾、蛋白表達(dá)的研究等。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，反應(yīng)敏感，結(jié)合顯著，重復(fù)性好。

 

技術(shù)背景

 

蛋白免疫共沉淀方法是運(yùn)用抗原抗體原理，識(shí)別和量化目標(biāo)蛋白，以及檢測(cè)其物理特性，進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法：用于分析后轉(zhuǎn)錄修飾、蛋白表達(dá)和酶活性等。免疫共沉淀技術(shù)通過(guò)四大步驟實(shí)現(xiàn)：第一，細(xì)胞或組織蛋白復(fù)合物樣品的萃取和活性維護(hù)；第二，運(yùn)用特異蛋白之抗體，免疫共沉淀細(xì)胞或組織裂解懸液中目標(biāo)蛋白；第三，蛋白質(zhì)A樹(shù)脂與蛋白－抗體復(fù)合物結(jié)合沉淀；第四，西方雜交分析目標(biāo)蛋白。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A） 100毫升

裂解液（Reagent B）       10毫升

結(jié)合液（Reagent C）      500微升

緩沖液（Reagent D）  30毫升

上樣液（Reagent E） 500微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)       1份

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）和結(jié)合液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；上樣液（Reagent E）避免光照，有效保證6月

 

用戶(hù)自備

 

特異抗體：用于目標(biāo)蛋白的結(jié)合

1.5毫升離心管：用于樣品反應(yīng)操作和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離細(xì)胞

震蕩器：用于混勻反應(yīng)物

4℃微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀樣品

4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀樣品

平式搖蕩儀或搖床：用于孵育和混勻反應(yīng)

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 樣品制備

 

（一）貼壁細(xì)胞裂解懸液制備

 

• 準(zhǔn)備100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿或75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞，直至生長(zhǎng)到80至90％鋪滿(mǎn)率（5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心抽去上清液
• 小心加入10毫升清理液（Reagent A），鋪滿(mǎn)生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）（注意：保留1毫升用于下一步操作）
• 即刻用細(xì)胞刮脫棒刮脫細(xì)胞
• 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升預(yù)冷的裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 每隔5分鐘渦旋震蕩5秒
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液到1.5毫升離心管
• 小心移取10微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 放進(jìn)冰槽里備用或保存在－70℃冰箱里

 

（二）懸浮細(xì)胞裂解懸液制備

 

• 準(zhǔn)備75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的懸浮細(xì)胞（5 X 10⁶細(xì)胞）
• 轉(zhuǎn)移到50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升預(yù)冷的裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 每隔5分鐘渦旋震蕩5秒
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液到1.5毫升離心管
• 小心移取10微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 放進(jìn)冰槽里備用或保存在－70℃冰箱里
  • 組織裂解懸液制備

 

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定組織重量
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入適量的（1克組織需要10毫升）清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 或置于液氮管過(guò)夜，次日取出后，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)15毫升錐形離心管
• 加入1毫升預(yù)冷的裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 每隔5分鐘渦旋震蕩5秒
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液到1.5毫升離心管
• 小心移取10微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 放進(jìn)冰槽里備用或保存在－70℃冰箱里

 

• 免疫沉淀反應(yīng)

 

• 移取250微升上述制備的裂解懸液樣品（總量為250微克總蛋白）到1.5毫升離心管
• 加入10微升用戶(hù)自備的特異抗體（多克隆抗體；總量為2微克）
• 放進(jìn)冰槽里孵育1小時(shí)，速度為100RPM（注意：可以延長(zhǎng)孵育至16小時(shí)）
• 加入50微升結(jié)合液（Reagent C）
• 平放置于4℃搖床孵育1小時(shí)，速度為100RPM（注意：可以延長(zhǎng)孵育至4小時(shí)）
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升緩沖液（Reagent D），充分混勻
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟8至10二次（注意：確保沒(méi)有液體殘留）
• 加入50微升上樣液（Reagent E），混勻
• 煮沸5分鐘
• 室溫下靜置10分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)冰槽里備用或保存在－70℃冰箱里
• 繼續(xù)后續(xù)西方雜交（WESTERN BLOT）實(shí)驗(yàn)

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為10次（5 X 10⁶細(xì)胞/次或1克組織/次）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 所有操作均須在4℃狀態(tài)進(jìn)行
• 本產(chǎn)品使用變性裂解處理；用戶(hù)可以根據(jù)需要，使用非變性裂解處理；建議使用非變性裂解液II－12054.2B
• 用戶(hù)可以萃取細(xì)胞核蛋白，用于免疫沉淀
• 本產(chǎn)品使用蛋白質(zhì)A樹(shù)脂，適合人體IgG1/2/4亞型，小鼠IgG1/2a/2b/3亞型和IgA，大鼠Ig1/G2c亞型，以及兔多克隆抗體，還有牛、馬、豚鼠、倉(cāng)鼠、豬等抗體
• 建議使用多克隆兔源抗體為佳
• 如果非特異性反應(yīng)明顯，建議加入2微克非相關(guān)性抗體和30微升結(jié)合液（Reagent C）到待測(cè)的裂解懸液進(jìn)行封閉預(yù)處理1小時(shí)（4℃狀態(tài)），離心后取上清進(jìn)行后續(xù)結(jié)合反應(yīng)
• 用戶(hù)可以使用0.1摩爾甘氨酸（GLYCINE）緩沖液（pH2.5）替代上樣液（Reagent E）進(jìn)行洗脫，可以減少非特異性洗脫
• 在－70℃冰箱里儲(chǔ)存的產(chǎn)品避免反復(fù)凍融
• 本公司提供系列免疫沉淀試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶

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