特殊石蠟切片組織衰老特異性脂褐素尼羅籃原位間接染色試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

特殊石蠟切片組織衰老特異性脂褐素尼羅籃原位間接染色試劑是一種旨在使用特殊固定處理和惡嗪染料尼羅藍A染色技術(shù)，（最大程度保留的）脂褐素沉積現(xiàn)象，從而在光學顯微鏡下觀察到深藍色表達的細胞作為細胞復制性衰老（replicative senescence）的分子特征來識別和探測衰老細胞的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心改良Lillie方法、成功實驗證明的。主要適用于石蠟包埋組織切片的脂褐素檢測。廣泛應用于細胞生物學研究。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。

 

技術(shù)背景

 

細胞復制性衰老是細胞控制其生長潛能的保障機制。衰老細胞停滯在細胞周期的G1期，表現(xiàn)出細胞扁平、脹大、顆粒增多的形態(tài)特征，其中脂褐素顆粒聚集增多成為細胞衰老的特征性生物學標記。脂褐素（lipofusin），又稱為“磨損（wear and tear）”色素，是一種細胞內(nèi)與年齡相關(guān)的棕黃色熒光胞漿顆粒色素，主要在有絲分裂后細胞的繼發(fā)性溶酶體內(nèi)。脂褐素常見于老年人的永恒性非分裂性組織細胞里，例如心臟、肝臟和神經(jīng)等，尤其在衰老誘導的細胞退變中聚集增多，特別是萎縮的組織。脂褐素來自于氧化的蛋白和脂質(zhì)，成為細胞衰老中后期的獨立指征。尼羅藍A（nile blue A），一種惡嗪（oxazine）染料，用于區(qū)分中心脂質(zhì)和膽固醇酯與游離脂肪酸和磷脂。在極度酸性條件下，特異性地與脂褐素發(fā)生反應，顯示深藍色，且易被二甲苯和乙醇脫色。由于組織切片在包埋前處理和染色前脫蠟的過程中，有機溶劑容易破壞和減少組織中的脂褐素成分，因此防護和固定組織中的脂脂褐素成分是尼羅藍染色的關(guān)鍵。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）  250毫升

固著液（Reagent B）   50毫升

乳化液（Reagent C）   50毫升

凈化液（Reagent D）  150毫升

氧化液（Reagent E）   50毫升

修復液（Reagent F）   50毫升

脫蠟液（Reagent G）         150毫升

補水液A（Reagent H）   50毫升

補水液B（Reagent I）   50毫升

補水液C（Reagent J）   50毫升

補水液D（Reagent K）   50毫升

染色液（Reagent L）    3毫升

產(chǎn)品說明書    1份

 

保存方式

 

保存在4℃冰箱里，染色液（Reagent L）具有腐蝕性，注意操作安全，避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

經(jīng)典水相封片液（12146）：用于染色后封片處理

無離子水：用于清洗樣品

無菌手術(shù)刀和鑷子：用于組織塊處理

恒溫培養(yǎng)箱：用于組織處理孵育

6孔細胞培養(yǎng)板：用于組織處理的容器

小型玻璃染色缸：用于組織或切片處理的容器

切片機：用于組織切片

明膠化載玻片和蓋玻片：用于切片后鋪片

光學顯微鏡：用于切片染色后觀察分析

 

實驗步驟

 

• 樣本固著處理

 

• 用無菌手術(shù)刀將新鮮組織切成2毫米厚的組織塊
• 即刻用無菌鑷子夾起組織塊，小心放進50毫升清理液（Reagent A）中浸泡3秒2次
• 轉(zhuǎn)移到5毫升固著液（Reagent B）里 
• 室溫下浸泡孵育24小時，避免光照
• 即刻用無菌鑷子夾起組織塊，小心放進上述50毫升清理液（Reagent A）中浸泡1小時
• 小心轉(zhuǎn)移到5毫升乳化液（Reagent C）里（注意：如果組織已經(jīng)使用福爾馬林固定的，則從這一步驟開始）
• 在56℃恒溫培養(yǎng)箱里浸泡孵育48小時，避免光照
• 準備1個6孔細胞培養(yǎng)板，分別加入5毫升凈化液（Reagent D）到3個孔里
• 再分別加入5毫升清理液（Reagent A）到另外3個孔里
• 小心轉(zhuǎn)移組織塊到上述6孔板的第一個孔里
• 室溫下孵育1小時
• 轉(zhuǎn)移組織塊到上述6孔板的第二個孔里
• 室溫下孵育1小時
• 依次直到第六個孔
• 小心轉(zhuǎn)移組織塊到新鮮的5毫升氧化液（Reagent E）里
• 在4℃冰箱里浸泡孵育24小時，避免光照
• 小心轉(zhuǎn)移到20毫升用戶自備的無離子水里
• 室溫下孵育24小時
• 小心轉(zhuǎn)移到5毫升修復液（Reagent F）里
• 室溫下浸泡孵育24小時，避免光照
• 小心轉(zhuǎn)移到20毫升用戶自備的無離子水里
• 室溫下孵育8小時（注意：可以孵育24小時）
• 用綿紙吸干組織快
• 即刻進行常規(guī)石蠟包埋過程的基本操作
• 取出組織塊，進行緩慢石蠟切片，為10微米厚，并鋪片在明膠化載玻片上

• 脫蠟處理

 

• 取出10片待測的10微米厚的石蠟包埋的組織切片
• （選擇步驟）放進80℃烘箱，孵育30分鐘
• （選擇步驟）室溫下靜置15分鐘
• 按下表依次放進小染色缸里孵育

 

染色缸	孵育時間
50毫升脫蠟液（Reagent G）	15分鐘
50毫升脫蠟液（Reagent G）	15分鐘
50毫升脫蠟液（Reagent G）	15分鐘
50毫升補水液A（Reagent H）	3分鐘
50毫升補水液B（Reagent I）	3分鐘
50毫升補水液C（Reagent J）	3分鐘
50毫升補水液D（Reagent K）	3分鐘

 

• 小心移去切片上的補水液D（Reagent K）
• 小心加上200微升清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）

 

• 樣本染色處理

 

• 小心加上200微升染色液（Reagent L）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育20分鐘
• 小心移去切片上的染色液（Reagent L）
• 小心加上500微升清理液（Reagent A）
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
• 重復實驗步驟4至6二次
• 放上蓋玻片或封片（水相） 
• 即刻在一般光學顯微鏡下觀察：

脂褐素陽性細胞呈現(xiàn)深藍色或藍綠色

紅細胞呈現(xiàn)黃綠色至藍綠色

黑色素呈現(xiàn)深綠色

背景呈現(xiàn)淡綠色

 

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為10次操作
• 操作時，須戴手套
• 建議組織塊厚度不宜超過2毫米，否則影響試劑滲透，保護脂質(zhì)成分
• 乳化液（Reagent C）為不透明的溶液
• 染色液（Reagent L）具有腐蝕性，注意操作安全，避免光照
• 鋪片須使用明膠化載玻片，否則染色會掉片
• 建議使用玻璃染色缸，除說明書規(guī)定之外
• 染色時更換試劑溶液時，保持切片面基本晾干
• 試劑溶液在切片表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿切片表面
• 整個操作，在避光狀態(tài)下進行
• 染色完成后，即刻進行光學顯微鏡觀察 
• 樣品染色后保存，避免光照
• 封片處理，避免使用有機溶劑類包括乙醇等，而使用水相封片液；建議使用經(jīng)典水相封片液（12146）
• 本公司提供系列細胞衰老分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰

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