細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性染色試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

 

主要用途

細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性染色試劑是一種旨在使用偶聯(lián)偶氮技術(shù)，在酸性環(huán)境和酒石酸存在的情況下， 呈現(xiàn)出紫紅色沉淀現(xiàn)象，來分析細(xì)胞樣本中抗酒石酸酸性磷酸酶表達(dá)的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心改良、成功實驗證明的。主要適用于動物原生代或培養(yǎng)細(xì)胞尤其是骨髓細(xì)胞和破骨細(xì)胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性檢測�？捎糜诠琴|(zhì)細(xì)胞病理生理的研究的鑒定。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，靈敏牢固，顯色清晰。

 

技術(shù)背景

 

抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase；TRAP）是一種在哺乳動物內(nèi)表達(dá)的糖化單體金屬蛋白酶，970多堿基，320多氨基酸，分子量為35kD。作為破骨細(xì)胞的標(biāo)志，抗酒石酸酸性磷酸酶與破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)的骨resorption活性和骨生成代謝有關(guān)�？咕剖�酸酸性磷酸酶是以酶原形式合成，通過蛋白酶裂解和還原后活化。在酸性環(huán)境下，催化磷酸酯鍵的水解，產(chǎn)生醇和釋放磷酸。其特征性為酒石酸抗性而與其它酸性磷酸酶區(qū)別。抗酒石酸酸性磷酸酶在破骨細(xì)胞（osteoclast）、活化的巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及懷孕期的豬內(nèi)皮層子宮內(nèi)膜（endometrium）高度表達(dá)。在網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖（leukaemic reticuloendotheliosis）或毛細(xì)胞性白血�。╤airy cell leukaemia）、戈謝�。℅aucher’s disease）、愛茲性腦病（HIV-induced encephalopathy）、骨巨細(xì)胞瘤（osteoclastoma）、骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）和代謝性骨病等病人體內(nèi)抗酒石酸酸性磷酸酶顯著增高�；�于底物萘酚AS-MX磷酸鹽（naphthol AS-MX phosphate），在酸性環(huán)境和酒石酸（tartrate）存在的條件下，酸性磷酸酶催化其水解，釋放出萘酚（naphthol-AS），進(jìn)而與重氮鹽耐曬紅紫（Fast red violet）偶聯(lián)，于是在酶的活動處形成不溶性紫紅色沉淀的偶氮染料，由此證明抗酒石酸酸性磷酸酶活性。其反應(yīng)體系為：

 

TRAP

naphthol AS-MX phosphate  ＋  H2O  →  naphthol AS  ＋  phosphate

tartrate

 

naphthol AS  ＋  Fast red violet  →  azo dye

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）   40毫升

固著液（Reagent B）   10毫升

反應(yīng)液（Reagent C）  200微升

染色液（Reagent D）   20毫升

產(chǎn)品說明書    1份

 

保存方式

 

保存反應(yīng)液（Reagent C）和染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

 

用戶自備

 

甲基綠復(fù)染試劑盒（40010）：用于常規(guī)染色后復(fù)染

1.5毫升離心管：用于配制染色工作液的容器

恒溫培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

光學(xué)顯微鏡：用于細(xì)胞染色后觀察分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將試劑盒里的反應(yīng)液（Reagent C）和染色液（Reagent D）從－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里等待溶化，并避光。然后移取1毫升染色液（Reagent D）到1.5毫升離心管，加入10微升反應(yīng)液（Reagent C），充分混勻后，標(biāo)記為染色工作液，室溫下，置入暗室。然后進(jìn)行下列操作：

 

操作一：細(xì)胞載玻片染色

• 樣本固著處理

 

• 取出待測的細(xì)胞載玻片 
• 小心加上200微升清理液（Reagent A）在載玻片上，鋪滿整個樣品表面
• 小心移去載玻片上的清理液（Reagent A）
• 小心加上200微升固著液（Reagent B），鋪滿整個樣品表面
• 室溫下，孵育2分鐘
• 小心移去載玻片上的固著液（Reagent B）
• 小心加上200微升清理液（Reagent A），清洗樣品表面
• 小心移去載玻片上的清理液（Reagent A）
• 重復(fù)實驗步驟7至8一次

二、樣本染色處理

• 小心加上200微升染色工作液，鋪滿整個載玻片樣品表面
• 在37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育15分鐘；或直至可見紫紅色（注意：避免光照）
• 小心移去載玻片上的染色工作液
• 室溫下，加上200微升清理液（Reagent A），清洗樣品表面
• 小心移去載玻片上的清理液（Reagent A）

 

• 樣本復(fù)染處理（選擇步驟）

 

• 樣本復(fù)染處理（甲基綠）
• 放上蓋玻片或封片
• 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察：陽性細(xì)胞呈現(xiàn)紫紅色，背景黃色，核為綠色

 

操作二：24孔細(xì)胞培養(yǎng)板染色

一、樣本固著處理

 

1．小心抽去24孔細(xì)胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)液

2．每孔加入400微升清理液（Reagent A），清洗生長中的細(xì)胞表面

3．小心抽去每孔里的清理液（Reagent A）

4．每孔加入400微升固定液（Reagent B），覆蓋整個生長表面

5．在室溫下孵育2分鐘

6．小心抽去固定液（Reagent B）

7．每孔加入400微升清理液（Reagent A），清洗細(xì)胞表面

8．小心抽去清理液（Reagent A）

9．重復(fù)實驗步驟7和8兩次

二、樣本染色處理

• 小心加入400微升染色工作液，覆蓋整個生長表面
• 在37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育15分鐘；或直至可見紫紅色（注意：避免光照）
• 小心抽去染色工作液
• 小心加入400微升清理液（Reagent A）
• 室溫下孵育2分鐘
• 小心抽去清理液（Reagent A）

 

三、 樣本復(fù)染處理（選擇步驟）

 

• 樣本復(fù)染處理（甲基綠）
• 小心加入100微升清理液（Reagent A）
• 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察：陽性細(xì)胞呈現(xiàn)紫紅色，背景黃色，核為綠色

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為50次操作（細(xì)胞載玻片）和25次（1個24孔板）操作
• 操作時，須帶手套
• 染色工作液配制后，即刻使用，不得超過1小時
• 染色工作液根據(jù)需要配制，每毫升，可以染色5個樣本
• 試劑溶液在樣品表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿樣品表面
• 細(xì)胞固定建議不要超過2分鐘，以免酶活性降低
• 如果樣品中酶活性較低，細(xì)胞染色可以延長至45分鐘
• 細(xì)胞染色注意不要過度
• 直接封片處理，不要使用有機(jī)溶劑（乙醇、二甲苯等），否則會使染色褪色
• 細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察 
• 本公司提供系列組織細(xì)胞酶活性染色試劑產(chǎn)品

 

 

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰

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