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總微型RNA（miRNA）分離試劑盒產品說明書（中文版）
主要用途
總微型RNA（miRNA）分離試劑是一種旨在通過快速裂解細胞，滅活RNAse酶，化學萃取以及特殊膠回收的技術處理，以獲得優(yōu)質純度的富集18至26堿基成熟總微型RNA的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種樣品（動物組織、植物材料、培養(yǎng)細胞等）的總微型RNA提取�？梢灾苯佑糜贜orthern雜交、斑點雜交、體外翻譯、RNA酶保護分析、RT-PCR、構建微型RNA文庫、miRNome技術等各種后續(xù)分子生物學實驗。產品即到即用，性能穩(wěn)定，無核酶污染，產量純度滿意，重復性好。
技術背景
成熟微型RNA（microRNA）分子是一種大小約21－23堿基的非編碼單鏈小分子RNA。它是由具有發(fā)夾結構的約70－90個堿基大小的單鏈RNA前體（PRECURSOR）經過DICER酶加工后生成。廣泛存在于動物或植物等生物體細胞內，參與調節(jié)特定mRNA的蛋白質翻譯過程來調控基因的表達。微型RNA表達具有時空和組織特異性，參與生命過程中一系列的重要進程，包括發(fā)育進程，造血過程，器官形成，凋亡，細胞增殖，甚至是腫瘤發(fā)生。
產品內容
裂解液（Reagent A） 40毫升
萃取液（Reagent B） 45毫升
沉淀液（Reagent C） 40毫升
保存液（Reagent D） 2毫升
標準液（Reagent E） 200微升
上樣液（Reagent F） 650微升
濃縮液（Reagent G） 40毫升
富集液（Reagent H） 120毫升
穿孔管 60套
濾芯管 60套
擠壓塞 1支
產品說明書 1份
保存方式
保存萃取液（Reagent B）和標準液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
用戶自備
HANK平衡鹽溶液（12028）：用于清洗組織或細胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于脫離培養(yǎng)細胞
完全細胞培養(yǎng)液（12052）：用于中和胰蛋白酶處理
15％聚丙烯酰胺尿素（8M）凝膠（12060）：用于分離純化微型RNA分子
電泳運行緩沖液（12061）：用于核酸電泳
RNA染色液：用于電泳后的RNA條帶染色
DEPC處理水（12046）：用于清洗膠體
50毫升錐形離心管：用于樣品預處理的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于RNA純化操作和保存RNA的容器
4℃臺式離心機（例如EPPENDORF5810R）：用于沉淀細胞
4℃微型臺式離心機（例如EPPENDORF5415R）：用于沉淀核酸
渦旋震蕩儀：用于混勻反應物
電泳儀：用于微型RNA的電泳操作
實驗步驟
- 總RNA分離
A) 組織總RNA分離
- 手術取出動物組織，并秤重以確定組織重量
- 放進預冷的50毫升錐形離心管
- 加入適量的（200毫克組織需要10毫升）用戶自備的HANK平衡鹽溶液清洗2次
- 移入一個液氮凍存管
- 即刻放入液氮罐過夜
- 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使樣品凍融）
- 放進一個15毫升錐形離心管
- 加入2毫升裂解液（Reagent A）
- 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
- 在室溫下孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒
- 加入2.2毫升萃取液（Reagent B）
- 渦旋震蕩30秒，充分混勻
- 在冰槽里孵育15分鐘
- 放入4℃臺式離心機離心15分鐘，速度為10000g
- 移出1.9毫升上層液相溶液到新的15毫升錐形離心管，留下100微升相位交界面的溶液
- 加入2毫升沉淀液（Reagent C）
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 放進－70℃冰箱里孵育1小時
- 放入4℃臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g
- 小心抽去上清液，空氣中晾干（表面呈濕潤狀）
- 加入150微升保存液（Reagent D）
- 放入－70℃冰箱里保存?zhèn)溆?/li>
B) 細胞總RNA分離
- 準備5瓶75cm2細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
- 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
- 分別加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面
- 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
- 輕輕抖動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落，然后各加入7毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
- 移入一個50毫升錐形離心管
- 放入臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
- 小心抽去上清液
- 加入20毫升預冷的用戶自備的HANK平衡鹽溶液，混勻細胞
- 放入臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入2毫升裂解液（Reagent A）
- 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
- 在室溫下孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒
- 加入2.2毫升萃取液（Reagent B）
- 渦旋震蕩30秒，充分混勻
- 在冰槽里孵育15分鐘
- 放入4℃臺式離心機離心15分鐘，速度為10000g
- 移出1.9毫升上層液相溶液到新的15毫升錐形離心管，留下100微升相位交界面的溶液
- 加入2毫升沉淀液（Reagent C）
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 放進－70℃冰箱里孵育1小時
- 放入4℃臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g
- 小心抽去上清液，空氣中晾干（表面呈濕潤狀）
- 加入150微升保存液（Reagent D）
- 放入－70℃冰箱里保存?zhèn)溆?/li>
- 總微型RNA分子純化
- 準備一個變性的15％聚丙烯酰胺尿素凝膠（建議3mm厚，10條泳道，垂直電泳）
- 移取8微升標準液（Reagent E）到新的1.5毫升離心管
- 加入2微升上樣液（Reagent F），混勻
- 同時加入30微升上樣液（Reagent F）到上述提取的RNA樣品管（150微升）中，混勻
- 將標準樣管和RNA樣品管放進65℃干式恒溫儀孵育5分鐘
- 放進冰槽里等待上樣
- 每孔上樣15－20微升，共10個泳道包括標準樣泳道
- 裝配電泳裝置，加入用戶自備的電泳運行緩沖液，進行電泳運行：電壓180伏，運行1小時或溴酚藍染料到達膠體底部
- 拆除電泳裝置，取出電泳玻璃板塊
- 分離玻璃板快
- 放入膠體在200毫升用戶自備的DEPC處理水中
- 加入適量的RNA染色液
- 室溫下孵育5分鐘，避免光照
- 在UV透射儀上，仔細切下電泳后聚丙烯酰胺尿素凝膠上的18至26堿基區(qū)域微型RNA條帶
- 放進穿孔離心管：9條泳道上膠體分別放進3個穿孔離心管
- 放進臺式微型離心機離心3分鐘，速度為13000RPM
- 去掉帶孔離心管，確保沒有凝膠物質殘留
- 分別加入300微升濃縮液（Reagent G）
- 渦旋震蕩15秒
- 放進4℃冰箱里孵育6至16小時，期間渦旋震蕩數(shù)次
- 分別移出300微升液體到濾芯離心管
- 放進4℃臺式微型離心機離心5分鐘，速度為13000RPM
- 分別切去2毫升離心管底部
- 用擠壓塞擠出所有膠體到濾芯離心管
- 放進4℃臺式微型離心機離心15分鐘，速度為13000RPM
- （選擇步驟）轉180度方向再離心15分鐘，速度為13000RPM
- 去掉濾芯
- 分別加入1毫升富集液（Reagent H）
- 渦旋震蕩15秒
- 放進4℃臺式微型離心機離心15分鐘，速度為13000RPM
- 小心抽去上清液，空氣中晾干（表面呈濕潤狀）
- 加入7微升保存液（Reagent D）
- 合并成1管（100－250納克/微升），放進－80℃保存
注意事項
- 本產品為20次操作
- 本產品純化的總微型RNA分子為成熟微型RNA分子，不同于其它技術所獲得的是200堿基以下的所有RNA分子
- 建議樣品量至少為200毫克組織或5 X 107細胞(約500微克總RNA量；50微克mRNA量；10微克200bp以下miRNA量；約2－5微克成熟miRNA量)；其它實際操作的組織或細胞量與試劑使用量成比例調整
- 整個操作須在4℃環(huán)境下操作，除特別指定的例外
- 整個操作須戴手套，建議使用濾芯槍頭，并格外小心，防止降解RNA
- 建議所有的操作用品屬于RNA專用
- －20℃冰箱里保存的試劑，避免反復凍融
- 標準液（Reagent E）為電泳時的18和26堿基分子標記
- 使用新的或經過酒精消毒的刀片切割條帶膠體
- RNA染色液建議使用SYBR Green
- 本公司提供微型RNA技術產品
- 本公司提供技術外包服務
質量標準
- 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
- 本產品經鑒定純度產量高
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