寡核苷酸探針同位素標(biāo)記DNA南方雜交印跡（Southern Blotting）完全試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

寡核苷酸探針同位素標(biāo)記DNA南方雜交印跡（Southern Blotting）完全試劑是一種旨在將復(fù)雜的DNA混合物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相膜上（如NC、PVDF）等，經(jīng)過非特異結(jié)合位點(diǎn)的封閉處理，進(jìn)行同位素標(biāo)記的探針與膜上的特定DNA序列結(jié)合，經(jīng)X光片（放射自顯影片）感光記錄其印跡的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于基因組中目標(biāo)基因序列的定位或定性檢測(cè)。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，敏感度高，顯影清晰，重復(fù)性好。

 

技術(shù)背景

 

南方雜交印跡技術(shù)（Southern Blot）是以愛德華 索森發(fā)明而命名的DNA檢測(cè)的經(jīng)典技術(shù)，即用于檢測(cè)固定在固相印跡膜上低達(dá)0.1pg的DNA分子。通過放射性同位素標(biāo)記，用X光片快速獲得永久的硬拷貝結(jié)果，或非放射性顯色系統(tǒng)，在固相印跡膜上直接顯色。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

緩沖液（Reagent A）   15毫升

濃縮液（Reagent B）    5毫升

沉淀液（Reagent C）   50毫升

凈化液（Reagent D）   50毫升

上樣液（Reagent E）   1毫升

膠底液（Reagent F）  15毫升

促進(jìn)液（Reagent G）  50微升

凝結(jié)液（Reagent H） 500微升

膠體液（Reagent I）  2 X 250毫升

電泳液（Reagent J） 250毫升

染色液（Reagent K）  50微升

酸性液（Reagent L） 100毫升

堿性液（Reagent M） 400毫升

清理液（Reagent N） 250毫升

封阻液（Reagent O） 100毫升

穩(wěn)定液（Reagent P）  10微升

引導(dǎo)液（Reagent Q）  20微升

聚合液（Reagent R）   5微升

結(jié)合液（Reagent S）   2毫升

強(qiáng)化液（Reagent T）  15毫升

產(chǎn)品說明書     1份

 

 

保存方式

 

保存濃縮液（Reagent B）、穩(wěn)定液（Reagent P）、引導(dǎo)液（Reagent Q）、聚合液（Reagent R）和結(jié)合液（Reagent S）在－20℃冰箱里；其余的保存在℃冰箱里；上樣液（Reagent E）、促進(jìn)液（Reagent G）和染色液（Reagent K），避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

基因組DNA：用于待測(cè)的樣品

內(nèi)切酶：用于分解基因組DNA樣品

無離子水：用于稀釋試劑溶液

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)物操作的容器

NC或PVDF固相膜：用于電泳后核酸轉(zhuǎn)移的載體

GB002/GB004濾紙：用于轉(zhuǎn)印時(shí)液體滲透

15毫升錐形離心管：用于溶液混勻的容器

三角玻璃燒瓶：用于溶液混勻的容器

塑料盒：用于膠體染色、清洗等操作的容器

電泳裝置：用于DNA電泳

UV紫外光：用于觀察DNA電泳條帶

雜交罐：用于DNA雜交

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于DNA沉淀

恒溫水槽或干式恒溫儀：用于反應(yīng)物孵育

渦旋震蕩器：用于混勻反應(yīng)

保鮮膜塑料紙：用于包裹轉(zhuǎn)印膜

X光片：用于發(fā)光顯影

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，準(zhǔn)備好待測(cè)的純化基因組DNA樣品。然后進(jìn)行下列操作：

 

• 樣品預(yù)處理
  • 準(zhǔn)備1個(gè)1.5毫升離心管
  • 按下表依次加入：

試劑溶液	用量
用戶自備的基因組DNA樣品	總量5微克
用戶自備的10 X 緩沖液	20微升
用戶自備的內(nèi)切酶	總量50單位
緩沖液（Reagent A）	總量到200微升

• 渦旋震蕩5秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育2小時(shí)
• 加入86微升濃縮液（Reagent B）
• 加入750微升沉淀液（Reagent C）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為13000RPM（或16000g，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent D）
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為13000RPM（或16000g，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液（注意：可以未見沉淀顆粒）
• 空氣中晾干
• 加入20微升上樣液（Reagent E）
• 渦旋震蕩5秒
• 置于－20℃冰箱備用

 

• 凝膠電泳

 

實(shí)驗(yàn)開始前，準(zhǔn)備1個(gè)1升三角玻璃燒瓶，加入50毫升電泳液（Reagent J），再加入450毫升用戶自備的無離子水，混勻后，標(biāo)記為電泳工作液。然后進(jìn)行下列操作：

 

• 準(zhǔn)備1個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入3毫升膠底液（Reagent F）
• 加入5微升促進(jìn)液（Reagent G）
• 加入50微升凝結(jié)液（Reagent H）
• 混勻后，即刻用5毫升移液管移入到垂直電泳玻璃板的膠體腔里
• 空氣中靜置至少5分鐘，直至膠體凝結(jié)
• 取出1個(gè)含有膠體液（Reagent I）的250毫升塑料瓶
• 置于微波爐加熱完全融化（注意：避免溢出）
• 置于室溫下冷卻5分鐘
• 倒入垂直電泳玻璃板的膠體腔里
• 插入泳道梳
• 空氣中靜置至少60分鐘，直至膠體凝結(jié)
• 安裝電泳槽
• 加入500毫升含有電泳液（Reagent J）的電泳工作液
• 小心移去泳道梳
• 小心去除泳道里的氣泡
• 加入20微升樣品到泳道里
• 加入適量的標(biāo)準(zhǔn)樣到另一泳道里
• 插上電源
• 運(yùn)行電泳：電壓為30伏，時(shí)間為16至24小時(shí)，直至藍(lán)色峰帶到達(dá)膠體底部為止
• 拆除電泳槽
• 在膠體右上角切掉一小塊，作為膠體定向標(biāo)記
• 放進(jìn)塑料盒里
• 加入100毫升用戶自備的無離子水
• 加入10微升染色液（Reagent K）
• 用手搖動(dòng)塑料盒，混勻
• 室溫下孵育30分鐘
• UV紫外光下觀察、拍照（注意：在膠體旁放上可見刻度的尺）
• 倒掉染色液
• 加入200毫升用戶自備的無離子水
• 用手搖動(dòng)塑料盒，混勻
• 小心倒掉無離子水
• 加入180毫升用戶自備的無離子水
• 加入20毫升酸性液（Reagent L）
• 用手搖動(dòng)塑料盒，混勻
• 室溫下孵育20分鐘
• 小心倒掉酸性液
• 加入180毫升用戶自備的無離子水
• 加入20毫升堿性液（Reagent M）
• 用手搖動(dòng)塑料盒，混勻
• 室溫下孵育20分鐘

 

• 轉(zhuǎn)印

 

• 準(zhǔn)備1個(gè)新的塑料盒
• 加入20毫升堿性液（Reagent M）
• 加入180毫升用戶自備的無離子水
• 用手搖動(dòng)塑料盒，混勻
• 無蓋塑料盒上放置一玻璃板
• 玻璃板上放上GB002濾紙，其兩端浸入塑料盒里的堿性液
• 取出膠體，置于濾紙上
• 剪下5 cm X 8 cm 轉(zhuǎn)印膜
• 用無離子水浸濕轉(zhuǎn)印膜，做好定向標(biāo)記
• 置于膠體上，去除氣泡
• 再放上堿性液濕潤(rùn)的GB002濾紙，去除氣泡
• 再依次分別放上1張干GB002濾紙和2張干GB004濾紙
• 然后放上5cm厚的紙巾
• 最后壓上玻璃板
• 室溫下轉(zhuǎn)印6小時(shí)
• 拆除轉(zhuǎn)印裝置
• 取出轉(zhuǎn)印膜

 

四、預(yù)雜交

 

1．準(zhǔn)備1個(gè)新的塑料盒

2．加入20毫升清理液（Reagent N）

3．加入180毫升用戶自備的無離子水

4．用手搖動(dòng)塑料盒，混勻

5．放入轉(zhuǎn)印膜

6．用手搖動(dòng)塑料盒

7．倒掉清理液

8．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2至7一次

9．將轉(zhuǎn)印膜放進(jìn)雜交罐

10．加入10毫升封阻液（Reagent O）

11．啟動(dòng)雜交罐，低于退火溫度（Tm）10℃條件下運(yùn)行2小時(shí)

 

五、探針制備

 

• 準(zhǔn)備1個(gè)1.5毫升離心管（注意：建議使用螺旋蓋的離心管）
• 加入6微升特定寡核苷酸DNA模板（總量為30納克）
• 加入2微升緩沖液（Reagent A），混勻
• 煮沸4分鐘
• 即刻置入冰槽里1分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒，速度為2000RPM（或500g，例如eppendorf 5415）
• 繼續(xù)加入1微升穩(wěn)定液（Reagent P）
• 加入4微升引導(dǎo)液（Reagent Q）
• 加入6微升同位素³²P標(biāo)記的dCTP（10微居里/微升；總量60微居里）
• 加入1微升聚合液（Reagent R）
• 渦旋混勻5秒
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒，速度為2000RPM（或500g，例如eppendorf 5415）
• 置于室溫下（25℃），孵育30分鐘
• 放進(jìn)95℃干式恒溫儀，孵育5分鐘
• 置于冰槽里備用

 

• 雜交

 

• 倒掉預(yù)雜交的封阻液
• 加入10毫升新鮮的封阻液（Reagent O）
• 加入400微升結(jié)合液（Reagent S）
• 加入20微升上述同位素標(biāo)記探針（1 X 10⁸ CPM）
• 啟動(dòng)雜交罐，低于退火溫度（Tm）10℃條件下運(yùn)行16小時(shí)

 

• 清理

 

• 倒掉雜交液
• 取出印跡膜
• 放進(jìn)新的塑料盒
• 加入200毫升用戶自備的無離子水
• 加入1毫升清理液（Reagent N）
• 加入1毫升強(qiáng)化液（Reagent T）
• 用手搖動(dòng)塑料盒，混勻
• 倒掉清理液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟4至8一次
• 將轉(zhuǎn)印膜放進(jìn)干凈的雜交罐
• 加入20毫升用戶自備的無離子水
• 加入300微升清理液（Reagent N）
• 加入100微升強(qiáng)化液（Reagent T）
• 啟動(dòng)雜交罐，低于退火溫度（Tm）12℃條件下運(yùn)行30分鐘
• 倒掉清理液
• 取出印跡膜
• 放進(jìn)新的塑料盒
• 加入200毫升用戶自備的無離子水
• 加入1毫升清理液（Reagent N）
• 加入1毫升強(qiáng)化液（Reagent T）
• 用手搖動(dòng)塑料盒，混勻
• 倒掉清理液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟18至22一次

 

八、顯影

 

1．用鑷子夾起固相膜，一角放在吸水紙上，吸干殘留液體

2．用保鮮膜塑料紙包住

3．置于X光片夾，在－70℃冰箱里，曝光16小時(shí)

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為5次（50個(gè)樣品）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 同位素操作須嚴(yán)格遵守規(guī)章制度
• DNA標(biāo)準(zhǔn)樣建議使用lambda HindIII，避免交叉反應(yīng)，而增加背景噪音
• 轉(zhuǎn)印時(shí)避免氣泡
• 可以使用自動(dòng)電轉(zhuǎn)印儀，按照生產(chǎn)商的操作指南操作
• 同位素³²P標(biāo)記的dCTP，建議使用AMERSHAM（安瑪西亞）公司
• 建議使用新鮮同位素材料
• 寡核苷酸探針模板長(zhǎng)度為20至40堿基為佳
• 建議探針標(biāo)記后即刻使用
• 建議使用螺旋蓋的離心管制備同位素探針
• 建議使用純化的探針模板DNA，減低背景噪音
• 標(biāo)記探針可保存在－20℃冰箱里。其半衰期為28天
• 理想標(biāo)記總活性為1 X 10⁸ CPM
• 聚合液（Reagent R）避免反復(fù)凍融
• 若需標(biāo)記活性檢測(cè)，建議使用同位素標(biāo)記放射活性TCA檢測(cè)試劑盒（11008）
• 若需探針純化，建議使用乙醇沉淀法DNA純化試劑盒（20002）
• 若需制備雙鏈探針，建議使用隨機(jī)引物DNA同位素標(biāo)記產(chǎn)物完全雙鏈制備試劑盒（11009）
• 曝光時(shí)間需根據(jù)情況調(diào)整
• 本公司提供系列DNA雜交試劑產(chǎn)品

 

 

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯影清晰

上海一基實(shí)業(yè)有限公司多年專供：ELISA試劑盒，PCR恒溫?zé)晒鉁y(cè)試盒、朗道校準(zhǔn)品、校準(zhǔn)質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品|對(duì)照品、抗體|抗原、生物試劑、動(dòng)物血清、人類CDNA、基因組DNA、MicroRNA產(chǎn)品、總RNA產(chǎn)品、人原代細(xì)胞裂解液、生物試劑、高端試劑等系列產(chǎn)品。如需產(chǎn)品詳細(xì)說明等物理性質(zhì)信息請(qǐng)聯(lián)系客服為您查詢！質(zhì)量保證，價(jià)格優(yōu)惠，是國(guó)內(nèi)生物試劑權(quán)威的供應(yīng)商之一，專業(yè)經(jīng)銷生物科學(xué)領(lǐng)域的品牌試劑：Sigma試劑、ASROS試劑、AIFA試劑、alding試劑、Fisher試劑、日本MBL試劑、美國(guó)劍橋CIL氘代試劑、ATCC菌株等品牌產(chǎn)品。擁有齊全的生產(chǎn)和檢測(cè)設(shè)備，實(shí)施嚴(yán)格的管理制度和完善的質(zhì)量保證體系，為廣大客戶提供全面的技術(shù)支持和完善的售后服務(wù)。歡迎來電咨詢!