真菌/酵母細(xì)胞脈沖凝膠電泳DNA樣品制備試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

真菌/酵母細(xì)胞脈沖凝膠電泳DNA樣品制備試劑是一種旨在通過生物酶處理，由特殊瓊脂包裹真菌/酵母原生質(zhì)體細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)行化學(xué)和生物雙重裂解和消化，有效地去除細(xì)胞中存在的酶類或核內(nèi)蛋白成分，獲得純化的超大分子DNA的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其應(yīng)用于后續(xù)酶切、脈沖場(chǎng)凝膠電泳、以及基因分型和遺傳指印分析等。適用于各種野生型或培養(yǎng)的真菌/酵母細(xì)胞株。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，質(zhì)量保證，重復(fù)性好。

 

技術(shù)背景

脈沖凝膠電泳（Plused-Field Gel Electrophoresis；PFGE）技術(shù)是一種應(yīng)用于分子生物學(xué)中分離純化大小在10～2000kb之間（極限達(dá)到10Mb） 的DNA 片段。解決了常規(guī)電泳無(wú)法分離的技術(shù)難題。首先通過特殊瓊脂包裹目標(biāo)樣品，裂解消化后獲得超大分子量DNA，然后使用限制性內(nèi)切酶處理，產(chǎn)生大小不等的片斷，然后將其置于脈沖場(chǎng)電泳槽中電泳，即兩個(gè)不同方向的電場(chǎng)周期性交替進(jìn)行，完成片段分離，進(jìn)行樣品的同源性分析，從而達(dá)到分型的目的。酵母細(xì)胞含有16個(gè)染色體，其大小在200至1600Kb，使用脈沖凝膠電泳技術(shù)可以更好地獲取染色體的物理和遺傳圖譜。

  

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）      120毫升

酶解液（Reagent B） 500微升

膠體液（Reagent C）      10毫升

裂解液（Reagent D）          50毫升

凈化液（Reagent E） 100毫升

保存液（Reagent F）         220毫升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存酶解液（Reagent B）、裂解液（Reagent D）和凈化液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶自備

 

YPD培養(yǎng)液（12074）：用于酵母細(xì)胞培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

2毫升離心管：用于樣品操作的容器

4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

恒溫?fù)u床：用于混勻反應(yīng)物

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

分光光度儀：用于測(cè)定酵母細(xì)胞濃度

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將膠體液（Reagent C）置于微波爐里加熱溶化（注意：避免溢出）或放進(jìn)60℃恒溫水槽融化，即刻放進(jìn)45℃恒溫水槽保溫備用。然后進(jìn)行下列操作

 

• 準(zhǔn)備好50毫升過夜生長(zhǎng)的新鮮酵母細(xì)胞
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升清理液（Reagent A），混勻
• 轉(zhuǎn)移到15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升清理液（Reagent A），混勻
• 調(diào)整細(xì)胞濃度：稀釋100倍的菌液OD600為0.5
• 移取1毫升菌液到2毫升離心管
• 加入50微升酶解液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)30℃恒溫水槽孵育60分鐘，期間每隔15分鐘輕輕用手搖勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升清理液（Reagent A），混勻
• 加入500微升45℃恒溫水槽預(yù)熱的膠體液（Reagent C）
• 快速槍頭混勻
• 放進(jìn)冰槽里孵育10分鐘，確保膠體凝結(jié)
• 取出膠體（可以使用1毫升槍頭的寬口插入或使用尖端環(huán)邊切開）到50毫升錐形離心管
• 加入5毫升裂解液（Reagent D），確保浸沒整個(gè)膠體
• 放進(jìn)48℃恒溫水槽孵育48小時(shí)
• 小心抽去裂解液
• 加入5毫升凈化液（Reagent E）
• 小心抽去凈化液
• 加入5毫升凈化液（Reagent E）
• 室溫下，放進(jìn)搖床孵育1小時(shí)，速度為100RPM
• 小心抽去凈化液
• 加入5毫升保存液（Reagent F）
• 室溫下，放進(jìn)搖床孵育1小時(shí)，速度為100RPM
• 小心抽去保存液
• 加入5毫升保存液（Reagent F）
• 小心抽去保存液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟35至36二次
• 加入2毫升保存液（Reagent F）
• 放進(jìn)4℃冰箱里保存或置于冰槽里準(zhǔn)備后續(xù)操作

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為10次（50毫升菌液）操作
• 所有操作均須在無(wú)菌狀態(tài)下進(jìn)行，尤其是使用清理液（Reagent A） 
• 操作時(shí)須戴手套
• 操作時(shí)，避免損壞膠體
• 酶解液（Reagent B）避免反復(fù)凍融
• 建議制備產(chǎn)物在1月內(nèi)使用為佳
• 本公司提供系列脈沖凝膠電泳試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定核酸質(zhì)量保證

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