純化線粒體ATP/ADP/AMP含量高效液相色譜法（HPLC）定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

純化線粒體ATP/ADP/AMP含量高效液相色譜法（HPLC）定量檢測試劑是一種旨在通過高氯酸酸性處理，堿性中和后，在高效液相色譜儀和紫外光度儀下（254nm波長）檢測分析，分離出ATP、ADP或AMP波峰，以定量測定樣品中腺嘌呤核苷酸含量的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動物或人體純化線粒體樣品中ATP、ADP、AMP的含量檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），簡稱腺苷，包括單磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一種單體單位，為核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）的組成成分，并提供化學(xué)能量，在能量代謝通路中維護(hù)諸如肌肉、胞膜等組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生化和生理功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞糖酵解、三羧酸循環(huán)、電子傳遞系統(tǒng)、氧化磷酸化活動。腺嘌呤核苷酸在細(xì)胞中濃度低，且不穩(wěn)定，通常通過其類型不同、濃度差異、分布狀況，來評價細(xì)胞的代謝情況和能量狀態(tài)。單磷酸腺苷（Adenosine monophosphate；AMP），又稱為5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸（5'-adenylic acid），是一種在（脫氧）核糖核酸中發(fā)現(xiàn)的核苷酸。它是一種磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸基團(tuán)、戊糖核酸糖及堿基腺嘌呤所組成。分子式為C10H14N5O7P，分子量347。AMP可以通過腺苷酸激酶（adenylate kinase）催化2分子ADP生成，或通過ATP以及ADP水解產(chǎn)生。AMP常以腺苷-3',5'-環(huán)化一磷酸（cAMP）形式存在于細(xì)胞中。AMP與ATP之比反映細(xì)胞ATP生成狀況以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；ADP），參與ADP-ATP循環(huán)，提供熱能轉(zhuǎn)換和動態(tài)平衡，尤其在線粒體需氧呼吸、光合成等實(shí)現(xiàn)。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代謝活躍的細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞活力的標(biāo)志。一旦細(xì)胞凋亡或壞死，ATP濃度急遽下降。通過高氯酸酸性處理，排除蛋白質(zhì)干擾，堿性中和后，在高效液相色譜儀和紫外光度儀下（254nm波長）檢測分析，分離出ATP、ADP、AMP波峰，以定量其含量。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）      100毫升

裂解液（Reagent B） 100毫升

酸性液（Reagent C）        5毫升

中和液（Reagent D）     1毫升

流相液A（Reagent E）      500毫升

流相液B（Reagent F）      500毫升

 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G） 500微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

 

 

 

保存方式

 

保存標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent C）和中和液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

 

用戶自備

 

HANK平衡鹽緩沖溶液（GMS12028）或PBS緩沖溶液（GMS12033）：用于清理細(xì)胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細(xì)胞脫離

完全細(xì)胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

4℃（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

高效液相色譜儀（HPLC）：用于定量測定

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 樣品準(zhǔn)備 

 

• 組織線粒體制備

 

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實(shí)驗(yàn)前最好使動物空腹12至24小時）
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入5毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進(jìn)一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入5毫升預(yù)冷的裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）（注意：參見注意事項(xiàng)8）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒
• 加入200微升預(yù)冷的酸性液（Reagent C）
• 渦旋震蕩1分鐘
• 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)再次離心10分鐘，速度為6000g
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入31微升中和液（Reagent D），充分混勻
• 置于冰槽里靜置30分鐘
• 即刻移入上清液到新的1.5毫升離心管（注意：避免移取沉淀顆粒）
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存或置于冰槽里待測

 

2）細(xì)胞線粒體制備

 

• 準(zhǔn)備1瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（1 X 10⁷），直至細(xì)胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
• 加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細(xì)胞生長表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，
• 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個50毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從此步驟開始）
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約40下）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒

• 加入200微升預(yù)冷的酸性液（Reagent C）
• 渦旋震蕩1分鐘
• 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)再次離心10分鐘，速度為6000g
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入31微升中和液（Reagent D），充分混勻
• 置于冰槽里靜置30分鐘
• 即刻移入上清液到新的1.5毫升離心管（注意：避免移取沉淀顆粒）

• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存或置于冰槽里待測

 

二、測定準(zhǔn)備

 

• 開啟儀器預(yù)熱15分鐘
• 根據(jù)下表設(shè)置高效液相色譜儀（HPLC）參數(shù)

 

 

參數(shù)	推薦	補(bǔ)充說明
色譜柱	長度：25cm 直徑：4.6mm	Waters儀器或 Agilent儀器
固定相	ODS
流動相	流相液A（Reagent E）和流相液B（Reagent F）	參見運(yùn)行程序
流速	1.3毫升/分鐘
注射容量	50微升	10微升至100微升
檢測	紫外
波長	254nm
柱溫	25℃
出峰時間（retention）	5.6分鐘（ATP）；6.5分鐘（ADP）；10分鐘(AMP)	參考
運(yùn)行時間	15分鐘	參考

 

• 運(yùn)行程序

 

運(yùn)行時段	程序	時間
開機(jī)后預(yù)運(yùn)行	100% 流相液A（Reagent E）	總10分鐘
檢測運(yùn)行時段	100% 流相液A（Reagent E） 0%流相液B（Reagent F）	0至9分鐘
	100% 流相液A（Reagent E）至 75% 流相液A（Reagent E） 0%流相液B（Reagent F）至25%流相液B（Reagent F）	9至15分鐘
關(guān)機(jī)前運(yùn)行	100% 流相液A（Reagent E） 0%流相液B（Reagent F）	總10分鐘

 

• 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

 

• 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管
• 分別加入100微升流相液A（Reagent E）到1至5號管
• 移取100微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到1號管，混勻
• 小心移取100微升1號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到2號管，混勻
• 小心移取100微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到3號管，混勻
• 小心移取100微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

 

管號	流相液A（Reagent E）	標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）	標(biāo)準(zhǔn)ATP/ADP/AMP濃度
1	100微升	100微升	100微摩爾/升
2	100微升	100微升1號管	50微摩爾/升
3	100微升	100微升2號管	25微摩爾/升
4	100微升	100微升3號管	12.5微摩爾/升
5	100微升	0	0

 

四、色譜分析

 

• 將上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）和待測樣品放進(jìn)冰槽里等待
• 每次（每個樣品）注射50微升
• 按照檢測運(yùn)行程序每次（每個樣品）運(yùn)行15分鐘
• 獲得色譜波峰圖：波峰面積（peak area）或峰值，保存記錄

 

五、計(jì)算樣本ATP/ADP/AMP濃度

 

• 方法一：通過儀器中的軟件進(jìn)行測算
• 方法二：構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為波峰面積（peak area）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)ATP/ADP/AMP濃度（微摩爾/升），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)ATP/ADP/AMP濃度（微摩爾/升）
• 方法三：公式計(jì)算（選擇單一濃度的標(biāo)準(zhǔn)液）

 

樣本ATP/ADP/AMP濃度（微摩爾/升）=【樣本波峰面積（peak area）X標(biāo)準(zhǔn)ATP/ADP/AMP濃度】÷對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)ATP/ADP/AMP濃度的波峰面積

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)液測定只需1次
• 試劑具有揮發(fā)性，注意密閉瓶蓋或使用封口膜
• 酸性液（Reagent C）和中和液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全
• 建議使用流相液A（Reagent E）作為陰性對照或作為基準(zhǔn)線
• 色譜柱的異物殘留、氣泡產(chǎn)生、溫度未達(dá)均衡等將導(dǎo)致異常波峰、時間偏移等
• 用戶可以使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)加入到樣品中，然后進(jìn)行萃取，檢測回收率（recovery）
• 腺嘌呤核苷酸的出峰時間（retention）以用戶操作時，使用的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）實(shí)際出峰為準(zhǔn)
• 用戶可以根據(jù)要求，計(jì)算實(shí)際濃度為：納摩爾/毫升、納摩爾/毫克蛋白等 
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 腺嘌呤核苷酸HPLC的參考圖譜如下：

 

 

 

• 本公司提供系列腺嘌呤核苷酸檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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