動物細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶活性化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

 

主要用途

 

動物細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶活性化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在使用化學(xué)方法，快速有效地裂解動物細胞，通過高速離心，獲得澄清細胞裂解懸液，在β-半乳糖苷酶反應(yīng)體系里，以人工合成的二惡二酮類化合物作為發(fā)光底物，水解所產(chǎn)生的發(fā)光產(chǎn)物，通過發(fā)光探測儀（Luminometer）測定其相對冷光單位（RLU）的變化，以此進行測算細胞裂解懸液制備樣品中的低表達β-半乳糖苷酶活性，藉此評價作為細胞復(fù)制性衰老（replicative senescence）的分子特征來探測衰老狀況的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和其它分子生物學(xué)研究。廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)研究。其適用于各種人體和動物細胞裂解懸液等樣品衰老細胞內(nèi)源性半乳糖苷酶活性分析。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，參數(shù)優(yōu)化，操作簡便、高度敏感。

 

技術(shù)背景

 

細胞復(fù)制性衰老是細胞控制其生長潛能的保障機制。衰老細胞停滯在細胞周期的G1期，表現(xiàn)出細胞扁平、脹大、顆粒增多的形態(tài)特征，尤其在酸性條件下，細胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活性增加，而成為細胞衰老的生物學(xué)標記。甲氧基二惡二酮氯代金剛烷苯基吡喃半乳糖苷（3- (4-methoxyspiro [1, 2-dioxetane-3, 2'- (5'-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7]-decan]-4-yl-phenyl -ß-D-galacto pyranoside），是一種二惡二酮（dioxetane）類發(fā)光底物，以替代乳糖，在β-半乳糖苷酶的催化下，去糖基化后，產(chǎn)生二惡二酮，進而在多聚苯甲基乙烷乙烯基苯甲氯化銨和熒光素鈉（poly (benzyldimethylvinylbenzyl) ammonium chloride and sodium fluorescein）的啟動反應(yīng)作用下，同時pH調(diào)整到12，由此二惡二酮分解，發(fā)出冷光，在冷光儀（475nm波長）下，檢測發(fā)光信號，來測定β-半乳糖苷酶的活性。其發(fā)光產(chǎn)物半衰期為10分鐘，檢測敏感度可達20飛克（fg）。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）     120毫升

裂解液（Reagent B）    10毫升

稀釋液（Reagent C）   600微升

反應(yīng)液（Reagent D）    12微升

堿性液（Reagent E）   2.5毫升

啟動液（Reagent F）   220微升

陰性液（Reagent G）    1毫升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）避免光照；堿性液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

 

用戶自備

 

β-半乳糖苷酶標準樣（GMS60003.2.2）：用于建立β-半乳糖苷酶標準曲線

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

黑色96孔板：用于冷光檢測操作的容器

恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

冷光儀：用于樣品冷光檢測

 

實驗步驟

 

實驗開始前，開啟化學(xué)發(fā)光儀預(yù)熱，設(shè)置波長475nm；開啟恒溫水槽，設(shè)置溫度為37℃。同時從－20℃冰箱里取出裂解液（Reagent B）和反應(yīng)液（Reagent D）等置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）避免光照。然后進行下列操作：

 

• 樣品準備

 

• 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測定準備

 

• 從-70℃取出上述制備的待測樣品，置于冰槽里 
• 反應(yīng)液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）嚴格注意避光
• 設(shè)定好化學(xué)發(fā)光儀：溫度為30℃預(yù)熱和運行程序（清洗步驟等）：整合5秒，并置零 
• 然后關(guān)掉實驗室的燈光

 

• 活性檢測

 

檢測開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化；然后移出100微升稀釋液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管，加入1微升反應(yīng)液（Reagent D），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為反應(yīng)工作液，放在暗室里。同時移出200微升堿性液（Reagent E）到另一新的1.5毫升離心管，加入20微升啟動液（Reagent F），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為啟動工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。

 

• 準備1個黑色96孔板，并做好標記：包括背景對照和待測樣品
• 分別加入50微升反應(yīng)工作液到所有測試孔里
• 加入5微升陰性液（Reagent G）到背景對照孔里
• 加入5微升待測樣品（50微克細胞裂解懸液蛋白）到待測樣品孔里
• 輕輕搖動酶標板，混勻
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 分別加入100微升啟動工作液到所有測試孔里
• 輕輕搖動96孔板，混勻
• 室溫下靜置10秒，嚴格避免光照
• 即刻放進冷光儀檢測：5秒整合檢測
• 獲得相對發(fā)光單位（Relative Light Unit；RLU）

 

• 樣品活性分析

 

1．計算公式

RLU_樣品活性－RLU_背景對照＝RLU_{樣品實際活性}

 

2．繪制RLU讀數(shù)（Y軸）和時間（X軸）關(guān)系曲線

 

五、樣品β-半乳糖苷酶實際活性單位計算（建議使用 β-半乳糖苷酶標準曲線化學(xué)發(fā)光法測定試劑盒－GMS10419.2）

 

• 構(gòu)建β-半乳糖苷酶標準曲線：橫座標（x軸）為每毫升β-半乳糖苷酶單位濃度；縱坐標（y軸）為標準樣品讀數(shù)（吸光單位OD值）
• 根據(jù)β-半乳糖苷酶標準曲線，測算樣品中含有β-半乳糖苷酶的活性單位（單位/毫克樣品）

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 本產(chǎn)品的各項參數(shù)達到最優(yōu)化
• 操作時，須戴手套
• 反應(yīng)液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）具有光高度敏感性，因此整個操作須避光進行，避免反復(fù)凍融
• 測讀的所有步驟均須在暗室里進行
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 用戶可以測定細胞裂解懸液的蛋白濃度，便于計算活性單位之需；建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量檢測試劑盒（GMS30030.1）
• 加入啟動工作液10秒后，即刻進行冷光測定
• 如果用戶沒有冷光儀，可以使用閃爍探測器（scitillation counter 或β計數(shù)器）替代，但敏感性較低
• 如果是注射式冷光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗冷光儀注射（injector）管道
• 相對發(fā)光讀數(shù)RLU（Relative Light Unit）越高，表明酶活性越高
• 測定后，專用測定杯須清洗徹底
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量 
• 用戶可以使用β-半乳糖苷酶構(gòu)建標準曲線，進行樣品酶活性單位檢測或使用 β-半乳糖苷酶標準曲線化學(xué)發(fā)光法測定試劑盒－GMS10419.2
• 本公司提供系列β-半乳糖苷酶檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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